脑缺血损伤及其体外细胞模型.ppt

cerebralischemiainjury 脑梗塞 疾病相关介绍 急性脑缺血级联反应 体外细胞模型 1 2 3 脑卒中 全球第三位死因 高发病率高死亡率高致残率高复发率 缺血性卒中占卒中86 缺血性卒中中 又包括短暂脑缺血发作 tia 脑血栓 脑栓塞和腔隙性梗塞 后三者在临床上有时不易区分 故统称为脑梗塞 脑梗塞致残率第一 致死率第二 每年死于脑梗塞的病人达150万现有脑梗塞病人750万到800万人我国每年用于脑脑梗塞的直接经济支出已近300亿元 每年全国新发病例250万 每12秒有一个中国人发生脑梗塞每21秒有一个中国人死于脑梗塞 脑部血液供应 脑部的血液供应主要来自两个系统 颈动脉系统 大脑前动脉 中动脉 前脉络膜动脉 眼动脉椎 基底动脉系统 左右椎动脉 基底动脉颈动脉系统 供应大脑半球前3 5部分椎 基底动脉系统 供应大脑半球后2 5部分 脑梗塞 病因 供应脑部的动脉系统发生粥样硬化等血管病变 致管腔狭窄或闭塞 进而血栓形成 造成脑局部血流中断 发生脑组织缺血 缺氧 组织软化 出现相应局灶性神经系统症状和体征 临床表现 颈动脉系统血栓 大脑中动脉主干缺血 开始上肢完全性软瘫 下肢有时尚能活动 大脑中动脉深支血栓 表现为持久的偏瘫 大脑中动脉上组皮质支血栓 有时对侧力弱 面部及上肢的感觉障碍 大脑中动脉下组皮质支硬塞 优势半球病变 感觉性失语 失读症 失算症及命名性失语 可有对侧偏盲 非优势半球病变 失认症 对自己形象歪曲或不能辨认 否认自己有神经系统疾病 临床表现 椎 基底动脉系统血栓 眩晕 头痛 眼球震颤 复视 同向偏盲 皮层性失明 眼肌麻痹 吞咽困难 构音障碍 交叉性麻痹及感觉减退 四肢瘫痪 共济失调 可有不同程度的意识障碍 脑梗塞按栓子来源分类 心源性 占60 75 栓子主要来源是风湿性心瓣膜病 心内膜炎赘生物及附壁血栓脱落等 以及心肌梗死 心房粘液瘤 心脏手术 心脏导管 二尖瓣脱垂和钙化 先天性房室间隔缺损等 非心源性 如动脉粥样硬化斑块脱落 肺静脉血栓或凝块 骨折或手术时脂肪栓和气栓 血管内治疗时血凝块或血栓脱落等 颈动脉纤维肌肉发育不良 女性多见 肺感染 败血症 肾病综合征的高凝状态等可引起脑栓塞 来源不明 约30 的脑栓塞 脑梗塞易发人群 脑梗塞临床治疗方法 预防复发防止并发症康复 急性脑缺血级联反应 在正常生理状态下 成人每100g脑组织血流量约为50ml min 当脑血流量处于或低于20ml时 缺血所致的级联反应开始被激活 出现不可逆性组织坏死 即脑梗死 急性脑缺血级联反应包括 神经细胞凋亡 炎症bbb破坏 脑缺血级联反应 能量耗竭 能量耗竭 脑占体重2 3 但需要的血液供应却占心排出量的20 脑细胞不能将脂肪 蛋白质或葡萄糖以外的碳水化合物作为能量来源 只能直接利用葡萄糖 脑缺血后 脑组织氧糖缺乏 发生能量障碍 脑血供停止6 8s 脑电活动即消失 30s神经代谢细胞代谢开始受累 2min神经细胞代谢停止 5min神经细胞开始死亡 大脑皮质开始出现永久性损害 缺血半暗带 急性脑血管闭塞 其周围区域即缺血半暗带区的神经组织仅出现代谢性损伤 功能损害 如能恢复血流灌注 其神经功能有恢复可能 脑缺血级联反应 细胞内钙超载 细胞内钙超载 能量代谢障碍直接抑制细胞质膜上na k atp酶活性 使大量k 内流 神经元去极化 电压依赖性与配体门控性ca2 通道激活 大量ca2 内流 脑缺血级联反应 兴奋毒性 兴奋毒性 谷氨酸 glu 是中枢神经系统 cns 主要的兴奋性神经递质 也是细胞通讯传递 生长 分化和可塑性的重要调质 同时又是一个很强的神经毒素 生理条件下 由于体内高效能的谷氨酸摄取系统的存在 使细胞外glu维持在较低的水平 仅有少量作为兴奋性神经递质参与信号传递 但在脑缺血时 glu大量释放和对谷氨酸受体 glurs 过度刺激 导致神经元兴奋 溃变 死亡 产生兴奋性毒性 脑缺血级联反应 自由基过度形成 在正常脑组织中 活性氧自由基 reactiveoxygenspecies ros 是通过内源性酶抗氧化防御系统 如超氧化物歧化酶 superoxidedismutase sod 谷胱甘肽过氧化物酶 glutathioneperoxidase gpx 过氧化氢酶 catalase cat 与非酶抗氧化防御系统 如谷胱甘肽 glutathione gsh 维生素c e等来维持平衡 自由基蓄积过多 攻击机体 即为氧化应激 自由基过度形成 自由基过度形成 nadph氧化酶首先发现于中性粒细胞和巨噬细胞 是由gp91phox p22phox p47phox p67phox p40phox和rac六种亚基组成的复合体 gp91phox是其主要的功能亚基即催化亚基 脑缺血后 nox2的活化通过一些激酶如蛋白激酶c proteinkinasec pkc 等 电子由nadph氧化酶转移至o2 产生超氧阴离子 o2 2o2 nadph 2 o2 nadp h 脑缺血级联反应 炎症andbbb破坏 炎症and血脑屏障被破坏 脑缺血一再灌注时 氧自由基及其他信使激活炎性细胞因子 释放趋化因子 上调黏附分子 在白细胞和内皮细胞的相互作用下 白细胞黏附于血管内皮细胞 从而阻塞微血管 导致微血管闭塞而引发 无复流现象 聚集的白细胞能够释放氧自由基 蛋白水解酶等直接损伤内皮细胞 破坏血 脑屏障 从而产生脑水肿 造成脑出血和神经元的损伤 同时 激活的白细胞在微血管内聚集 释放大量的炎性介质和细胞因子 使更多的中性粒细胞聚集到炎性反应部位 从而加重炎性反应 造成恶性循环 脑缺血级联反应 神经细胞凋亡 脑缺血诱导细胞凋亡两步 脑缺血时 glu浓度升高所产生的早期兴奋毒性主要通过ka受体和ampa受体 由nmda受体介导的神经元迟发性损伤 可在数小时至数日发生 以细胞内钙超载为特征 脑缺血体外细胞实验 神经元模型胶质细胞模型内皮细胞模型 共培养模型 缺血模型 细胞模型 神经元与胶质细胞共培养bbb模型脑片模型 直接诱导法间接诱导法 细胞模型 神经元模型原代神经元培养 多采用15 18d孕龄的胎鼠或新生鼠 经取材 机械分离 酶消化等步骤获得细胞悬液 接种至包被多聚赖氨酸的培养皿内 用添加b27的neurobasal nb 无血清培养基培养 并用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长 可获得纯度较高的原代培养神经元 培养5 7d后用于实验 由于海马对缺氧较为敏感 因此常从海马组织中分离原代神经元用于研究 传代细胞系 如小鼠来源的neuro 2a细胞和ng108 15细胞 大鼠来源的b104细胞 pc12细胞 人来源的sh sy5y细胞等 细胞模型 胶质细胞模型原代胶质细胞培养 胶质细胞原代培养的取材过程与神经元原代培养类同 只是培养时换成利于胶质细胞生长的dmem f12完全培养基 含10 胎牛血清 体外培养l0 12d后细胞融合并分层 上层主要为小胶质细胞 下层主要为星形胶质细胞 然后 可采用多种方法进一步纯化 传代的胶质细胞系 小鼠胶质细胞系 bv2细胞 n9细胞 c8 b4细胞 大鼠胶质细胞系c6细胞以及人星形胶质细胞u251 细胞模型 内皮细胞模型原代内皮细胞培养 一般从成年动物大脑皮质取材 剪刀破碎成1mm大小 胶原酶消化后 经密度梯度离心或过筛方法获得 然后接种至 型胶原包被的培养板内 培养4 5d后融合形成紧密连接的单层细胞 内皮细胞单层或由内皮细胞层构成的体外bbb模型 经ogd诱导缺血后 内皮细胞问紧密连接遭到破坏 通透性增加 跨内皮电阻 transendothelialelectricalresistance teer 减小 与体内状态相似 细胞共培养模型 神经元与胶质细胞共培养 利用胶质细胞滋养层进行分离式原代神经元培养的方法 又称细胞培养小室或transwel小室 分别将纯化的胶质细胞和神经元接种于插入式培养皿的微孔膜和6孔板内的盖玻片爬片上 混合培养 类似原代培养神经元的获取和培养过程 只是培养基中不添加阿糖胞苷 但添加5 胎牛血清 神经元和胶质细胞共同生长在一个培养层 banker共培养 插入式培养皿 细胞共培养模型 bbb模型 来源于成年鼠的bmec与来源于新生鼠的胶质细胞共培养 bmec在半透膜上进行单层培养 胶质细胞在半透膜下的培养孔中生长 通过检测teer transendothelialelectricalresistance 跨内皮电阻 和内皮通透系数 endothelialpermeabilitycoeficient pe 来监测内皮细胞功能 检测闭锁小带蛋白1和闭合蛋白这2种参与内皮细胞紧密连接的重要蛋白 可反映内皮细胞结构的完整性 虽然该模型中内皮细胞的teer和pe相对低于体内状态 但具有与体内状态一样的细胞特性 细胞共培养模型 脑片模型 脑片多来源于出生后6 8d的大鼠 也可采用未成年或成年大鼠 最常用的是海马组织 因为其解剖学结构明确而且对缺血性损伤最为敏感 相对于原代培养神经细胞 脑片可在体外培养数周时间 能保留体内状态下细胞间的相互作用和三维立体结构 具有正常和完整的突触通路 递质传递和电生理等功能 同时 脑片培养排除了体内模型中bbb的干扰 可采用人工培养基或添加各种药物 易于控制培养环境 脑片模型 脑片培养方法 a 旋转管法b 半透明膜法 缺血模型 直接诱导法 ogd 化学药物 ogd是使用低氧装置 如三气培养箱 结合无糖培养基或是向无糖培养基中持续通人不含氧的混合气体 5 co2 95 n2 来模拟缺糖缺氧环境 经ogd处理一段时间后 可转移到正常氧浓度和含糖培养基条件下继续培养 以模拟细胞或组织缺血再灌注损伤的病理生理学过程 叠氮化钠 氰化钠等氧化代谢抑制剂能通过与细胞色素氧化酶紧密结合来抑制氧化磷酸化过程和阻止线粒体产生atp 三气培养箱 缺血模型 间接诱导法 兴奋性毒性损伤模型 氧化应激性损伤 一般采用谷氨酸或谷氨酸盐和nmda等试剂 100 mol l的谷氨酸盐作用于皮质神经元5min即可造成大量损伤 主要采用过氧化氢或叔丁基过氧化氢可模拟脑缺血和缺血再灌注产生的活性氧 超氧阴离子 过氧化氢 羟自由基等 所引起的氧化应激损伤 但是 目前对于其使用浓度和作用时间尚缺乏统一标准 这些活性氧与培养物类型和培养条件有关 缺血模型 间接诱导法 一氧化氮 nitricoxide no 损伤 炎症反应 no具有神经保护和神经毒性双重作用 硝普钠 sodiumnitroprusside snp 可用作外源性no供体 对于体外培养的小胶质细胞或脑组织 可给予脂多糖诱导小胶质细胞