肺动脉平滑肌细胞原代培养原代培养.doc

肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程一、实验准备1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。2、75消毒用酒精2瓶，5%碘酒1瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，M199培养基100ml（含4mmol/L的谷氨酰胺、15%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。3、生物安全柜2个，解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿5个，培养瓶5个，1ml吸管20根，弯头吹打管10根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。二、操作步骤1、洗手，戴口罩帽子及手套。2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，碘酒酒精消毒解剖板（包括绳子），换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。打开紫灯消毒30min。5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。10、在无PBS的培养皿中将肺动脉剪成1mm3大小的组织块（剪碎的组织块常粘在一起，故应用十分锋利的眼科剪才好操作）。11、用弯头吹打管将剪好的组织块放入培养瓶的底部，分散成1cm2/块（注意培养瓶应干燥，事先不加入PBS或培养液）。12、旋紧瓶盖，放入37度的孵箱中1.5到2小时。13、取出培养瓶，翻转，使贴有组织的底面朝上，背面向下。于背面注入M199培养液5-7ml，再缓慢翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中（此时会有一些组织块漂起来，故动作应十分轻柔，只要有一块组织贴壁，就有成功的希望）。高糖DMEM+10%新生牛血清(华西哈里)；14、将培养瓶放入37度、5%CO2的孵箱中培养，3-5天换液一次。15、一般7天左右可观察到细胞从组织块周围长出，如超过10天未见细胞生长则试验失败。三、注意事项1、应树立外科无菌术的观点，严格无菌操作，勤换手套，否则试验不易成功。2、生物安全柜内严禁使用酒精灯，因其会干扰正常气流，反而不利于无菌操作，并有引发火灾的危险。3、一只老鼠可作2-4个培养瓶。建议1天只做1只老鼠，连做3-4天，本人也是到了第3、4只老鼠才成功。4、培养液应当选择比较好的。我用的是：M199培养基（美国Hyclone公司、液体、500ml/瓶），胎牛血清含量应为15%（Hyclone公司、原装进口、500ml/瓶，1680元，自己分装），青霉素、链霉素均为20万IU/L。5、分离肺动脉和将组织贴壁于培养瓶这两部是决定成败的关键，应仔细、耐心。6、此操作可一人单独完成，但初次操作可请一名助手协助。我在做原代的时候，去除组织后都在含15%的PBS中清洗三次再剪碎，建议你把紫外灯开整晚，早晨再做一次看看，洗液中双抗的浓度一般为培养液中的二倍。所以在泡酒精之前都会用水冲几次,酒精浸泡的时间可以适当再长点. 戴口罩可帽子先拿新洁尔灭给老鼠洗个澡，然后把它放在消过毒的解剖盘中，放在洁净台中，用紫外灯照15min左右，在洁净台中做下一步。解剖过程中的手术器械要高温灭菌后才能使用，PBS中不用加双抗。1. 我用的是DMEM培基，而且觉得原代培养用GIBCO的培基比用Hyclone的更好。（不能确定什么具体成分起了作用，也许是偶然）胎牛血清含量我一般调到20%，传代后用10%即可，但原代以10%浓度培养不容易长出。2.培养皿一般准备3个，2个装PBS，1个装培基。心肺分离出来后直接转至细胞室无菌操作台，放入装PBS的培养皿洗净，初步去除结缔组织，之后转移至另一个PBS培养皿，分离出肺动脉，最后在含培基的培养皿中剪切肺动脉，以口腔科用的探针送入培养瓶，非常好用。3.培养瓶用一次性进口塑料瓶比玻璃瓶更好。组织块放入后翻转瓶子使组织块朝上，加入培基，4小时后翻瓶，细节同楼主所说。4.一帮3-5天即可见细胞爬出，长到50%左右可换液去除GIBCO的C11995及C11330均可,但最好用后者有几点我个人的经验：1.取材要熟练，尽量缩短时间，如果可以把从取材到铺瓶的时间缩短到15分钟以内，那么最终的成功率会比较高。时间拖得越长，最终的细胞长出来的时间越是慢甚至最后会失败。2.铺瓶后，第一次翻正瓶子的时间控制在1.5小时，但是最终还是看你铺瓶时组织的湿润程度；之后尽量不要再去动瓶子，至少2天内不要动，这样避免铺上去的组织脱落悬浮。如果你实在担心是否受污染的话，就看看培养基的颜色就是了。3.在第一次原代组织铺瓶时最好使用进口胎牛血清培的高糖DMEM，血清浓度为10就可以了。如果你是使用四季清的话，不是说不可以，但是时间绝对会让你等到心理快承受不了的时候，才发现几个细胞的爬出来。但是也可以通过加大血清浓度到15来达到进口胎牛血清的营养水平。4.在细胞传到第三代开始，可以使用国产血清了，同时你也要准备好大量培养瓶，因为这个时候，细胞可能3天就可以铺满一个50ML的培养瓶了。具体的方法：（我曾经在硕士时养过二百瓶左右，有问题尽管问）原代培养：清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜23遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置34小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。一般47天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，23周出现致密细胞层。 待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。细胞传代： 将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。弃掉清洗液， 加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为24 min。这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。然后根据细胞密度, 以1: 24分瓶培养。每23天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为710天)再传代。血管平滑肌细胞组织贴块法培养技巧血管平滑肌细胞培养常用于动脉粥样硬化等多种与血管平滑肌细胞异常增殖有关疾病的发病机理及药物作用机制的研究。提高培养成功率是进行血管平滑肌细胞的分子生物学研究的先决条件。作者多次采用组织贴块法培养兔胸主动脉平滑肌细胞，现提出几点看法。1 组织块大小、边缘、干涸时间及观察时间对原代细胞萌发的影响对于贴块法的原代培养来说，由于细胞是从组织块边缘长出，其中有一萌发过程，且细胞萌发后尚需一定的细胞密度才能使其存活、增殖，故组织块大小、边缘、密度均影响细胞萌出与否及细胞存活、增殖。公认的方法是将血管剪成1mm3大小组织块1-3。张映娜等认为组织块0. 52 mm3范围内，大小影响不大(可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁)4。但如组织块超过2mm3将增加细胞萌出的阻力。组织块边缘过度受损将使细胞很难萌出。作者认为剥除内膜、外膜时用力适中，尽量减少机械拉伤，可将镊子夹过处切去，剪切时力求一次剪断。切组织块时不要离开培养液操作，保持组织块湿润，减少组织块边缘受损。干涸时间一般认为36 h，宜短不宜长。一般57d后观察可见细胞从组织块边缘呈放射状长出，但5d内不宜移动培养瓶，以免贴壁的组织块脱落，脱落的组织块不可能再贴壁。2 部分换液与全部换液的比较一般认为培养液变黄，则全部倾去培养基换新鲜培养液。经过摸索，作者发现换液时保留1/41/5旧培养基在细胞增殖速度、细胞状态方面优于全部换新鲜培养基。这可能与旧培养基的微酸状态及含有一些细胞因子有关。3 牛血清的类型、浓度对血管平滑肌细胞的影响血清是培养细胞不可缺少的天然培养基，血清的质量直接影响细胞生长、增殖及功能状态1。选择价廉、质优、合理浓度的血清用于细胞培养很重要。作者分别用四季青公司胎牛血清、小牛血清进行原代、传代比较。结果表明，原代培养需用20%胎牛血清 , 而小牛血清用于原代培养效果很差，传代培养可用10%胎牛血清或15%小牛血清。 4 第一次传代时机的把握及注意点一般的培养方法是选取细胞达亚融合状态时进行传代1-3。但贴块法原代培养时细胞生长往往不均匀，经常是一些区域已长成致密细胞层，一些区域仍未见细胞生长，这种情况下,当整瓶细胞达亚融合时，致密细胞层已老化。作者通过摸索，认为当原代培养57 d后可移出培养箱观察，如培养基变黄可部分换药继续培养，每隔12d观察一次。瓶中若有部分区域达到亚融合状态即可传代，或到10d左右仍未达到亚融合状态，但达到50 %左右融合亦可进行传代，为保证传代细胞密度可将细胞传至小体积培养瓶培养。血清浓度不减少，或减少至15%为宜。若锐减血清浓度至10%，常可导致细胞生长减慢。6 传代操作要领（1）消化要领一般认为细胞传代消化以细胞成片收缩，变圆变亮，细胞间隙增大时为宜。它主要取决于胰蛋白酶的浓度、pH 值、温度和作用时间，而各实验室报道不一5-7。过高浓度的胰蛋白酶达到适宜标准的时间短，仅数十秒，不易控制，易使消化过度。浓度过低，达到适宜标准的时间过长，易严重损伤细胞膜，细胞难以贴壁。作者用不同浓度的胰蛋白酶及不同浓度的胰蛋白酶与EDTA混合液均成功地进行了传代培养。胰蛋白酶及EDTA的浓度各实验室可以不同。作者认为消化要掌握以下二个关键。传代的第一个关键是用PBS充分洗涤，以彻底除去培养瓶中残留的血清，从而避免残留的血清对胰蛋白酶的灭活作用，严重影响操作者对消化过程的把握。第二个关键是以倒置显微镜下连续观察为消化适宜的金标准，而不应以肉眼观察为依据。消化过程中最好在倒置显微镜下连续观察，当细胞成片地收缩、细胞间隙增大时，立即翻转培养瓶使细胞脱离消化液，倾去消化液，加入含胎牛血清的培养基中止消化。中止消化操作要快，以减少胰蛋白酶对细胞的损伤。（2）吹打要领 用吹打管将细胞自培养瓶瓶壁上轻轻吹打下来，应按顺序吹打培养瓶各处，吹打过程中尽量避免产生气泡。作者通过对兔胸主动脉平滑肌细胞培养的多次摸索与实践,优化培养方法，使组织贴块法更经济实用，提高了培养成功率。 Cell Counting Kit-8：不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。500次198元。以前做过一段时间的大鼠PASMC培养，用的是组织块法（基本步骤同司徒镇强的细胞培养）：(1) 体重100g左右的大鼠10%乌拉坦腹腔注射麻醉后，2%碘酒75%酒精消毒。剖开胸腔迅速取出心肺，置于无血清DMEM培养液中。 (2) 超净工作台上分离肺动脉主干及左右肺动脉DMEM培养液漂洗至凝血洗净(3) 用弯头小镊小心剥除外膜的纤维脂肪层，并用虹膜剪沿血管外侧纵向剪开在DMEM培养液中漂洗2次 (4) 将血管内膜面向上用单面刀片自上而下刮23次以去除内皮细胞 (5) 将剩余的中膜剪为0.5mm2的小块，用弯头滴管移入到培养瓶内组织块之间距0.5cm左右，将培养瓶翻转，植块面在上，置于培养箱中2h后，再轻轻翻转过来，并加入含20%胎牛血清的DMEM培养液使组织块浸泡在培养液中。（亦可24小时再补加培养液，这样较容易贴壁）。静置3-5天或1周，观察及换液，此后改用含10%胎牛血清的DMEM培养液每隔3天换液一次，当细胞生长至铺满瓶底80%左右时用0.1%胰蛋白酶消化分散细胞进行传代培养，第4-10代的细胞用于实验 。在实验中，可采用细胞分裂相脱离同步化法，使细胞进入同步化生长具体方法是：当PASMC进人对数生长期时，把培养细胞置入4C冰箱 6 h，然后取出重新放回 37 C孵箱继续培养 8 h，这时有 80的细胞进人分裂期从孵箱中轻轻拿出培养瓶，用吸管吸去培养液，以去掉死细胞和未贴壁的细胞，然后再加入新培养液，手平持培养瓶反复摇动，使培养液不断冲刷细胞层，能把分裂中变圆的细胞从瓶壁上冲刷下来，倒出培养液，分装人另一培养瓶继续在此 37 C孵箱内培养，多数细胞可进入同步化生长至于取哪一段肺动脉，取决于你的实验要求，肺动脉干和左右主肺动脉基本上没有什么差别，可以都取上。如果研究肺动脉高压，应该是更细的阻力性肺血管较好，因为离子通道和受体的分布在这