制药微生物菌种建立.ppt

项目二微生物发酵制药工艺 2 1概述2 2微生物生长与生产的关系2 3制药微生物菌种建立2 4制药微生物培养基制备2 5灭菌工艺2 6微生物发酵培养技术2 7发酵工艺过程的检测与控制 2 3制药微菌种的建立 2 3 1新药生产菌种的选育2 3 2菌种保藏2 3 3菌种库建立与质量控制 制药生产对菌种的要求 1 遗传稳定性 能长期繁殖 不易变异和退化 纯种 无杂菌及噬菌体 2 易生长性 生长旺盛 迅速 4 容易培养性 条件易控 利用价廉易得的原料 3 抗污染性 自身保护机制 抵抗杂菌污染能力强 4 经济性 发酵周期短 产量高 良好经济能力 5 突变敏感性 对各种诱变较敏感 提高的潜力大 菌种选育的目的 改善菌种的特性 使提高产量 改进质量 降低成本 改革工艺 方便管理及综合利用 2 3 1 1自然分离 目的 出发菌的获取样品的采集 大陆表层土壤 海洋水体预处理 根据分离目的和微生物的特性 温度 化学处理 离心 膜过滤培养基 选择性 营养和ph 添加抑制剂 分离方法 1 稀释法 无菌水 生理盐水 缓冲液 2 滤膜法 细菌在膜上 放线菌进入培养基 培养条件 温度 放线菌 25 30 32 37 45 50 7 14天至1月 药物的筛选 琼脂扩散法 活性测定 非致病菌为对象 筛选生物活性物质 耐药和超敏菌种 hplc lc ms等 分析鉴定活性物质 靶向筛选高通量筛选高内涵筛选 微生物药物与菌种的筛选流程 样品采集 微生物分离 培养 筛选鉴定 筛选方法学建立 阳性结果 化合物分离纯化鉴定 前药 新化合物 新药研究与开发 菌种鉴定与保藏 生产出发菌 2 3 1 2生产选育 概念 不经过人工诱变处理 根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程 应用 1 菌种的提纯复壮 2 防止退化 稳定生产水平 1年1次 过程 菌种 单孢子 单菌落测活 平板分离 优良菌株 效率低 2 e5 e8 增产幅度小 2 3 1 3诱变育种 概念 人为创造条件 诱变剂处理 使菌种发生变异 筛选优良个体 淘汰劣质个体 物理类 紫外线 快中子 激光 太空射线 化学类 碱基类似物 嵌合剂 亚硝酸 生物类 噬菌体 转座子 特点 快速 简单 效益大 缺点 无定向性 大量筛选 诱变方案设计 出发菌种的选择 较高产 对诱变剂敏感 诱变剂的使用 交叉使用多种 合理组合 中等剂量 80 致死率 选择压 施加一定的选择压 获得耐药菌株 措施 添加抗生素 提高前体浓度 增加产物浓度 诱变育种流程 出发菌种 单孢子悬液 稀释涂板 单菌落初筛 高产菌株 诱变处理 稳定性特性 放大中试 复筛 投入生产 2 3 1 4原生质体融合育种 概念通过化学或物理学的方法 使两个不同种类的体细胞融合在一起 形成杂合细胞 产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞 特点 有一定的定向性 效果显著 d 筛选 鉴定 e 高产菌株 a 原生质体制备 用去壁酶处理将微生物细胞壁除去 制成原生质体 操作过程 c 细胞壁再生 b 原生质体融合 异核体或重组子 菌株1 菌株2 去细胞壁 原生质体1 原生质体2 高渗 peg处理 杂合原生质体 2 3 2菌种保藏 原因 菌种经过多次传代 会发生遗传变异 导致退化 从而丧失生产能力甚至菌株死亡 目的 保持菌种原有优良特性 延长生命时限 长期存活 不退化 不污染 随时为生产供菌 原理 使菌种代谢处于不活跃状态 即生长繁殖受抑制的休眠状态 措施 物理和化学方法 温度 低温 水分 干燥 氧气 缺氧 营养 缺乏 保藏方法比较 2 3 3菌种库建立与质量控制 依据 gmp对药品生产的有关要求和规定建立各级种子细胞库 实施种子批系统管理 进行验证确保菌种的稳定 无污染 保证生产正常有序进行 建库的流程 主菌种库mcb 来源于原始菌种或细胞培养物工作菌种库wcb 由主菌种库或主细胞库繁殖而来 菌种库的质量管理 保藏机构 中国 中国典型培养物保藏中心 chinacenterfortypeculturecollection cctcc 中国科学院典型培养物保藏委员会 下设9个库中国普通微生物菌种保藏管理中心 chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter cgmcc 微生物所 真菌和细菌 武汉所 病毒 抗生素菌种保藏管理中心 cacc 中国医学科学院抗生素所 四川抗生素所 华北制药集团抗生素所 保藏机构 国外 wfcc worldfederationforculturecollections http www wdcm riken go jp wfcc thml美国的典型菌种保藏中心atcc americantypeculturecollection http www atcc org 日本发酵研究所ifo instituteforfermentation osaka japan英国国家典型菌种保藏所nctc nationalcollectionoftypeculture london uk 小结与要求 生产菌种选育 自然分离获得出发菌种 生产选育 诱变和原生质体融合 shuffling 提高菌种生产性能菌种保藏 防止失活和退化 物理手段 建立菌种库 gmp的要求 质量控制 保证生产菌种活力和供给 了解菌种选