枯草芽孢杆菌固定化细胞及其净化水质的探讨.doc

本科生毕业论文题 目：枯草芽孢杆菌固定化细胞及其净化水质的探讨 姓 名： 黄兆峰 学 号： 080500130 学 院： 生物科学与工程 专 业： 生物工程 年 级： 05级 指导教师： （签名）2009年 6 月 3 日枯草芽孢杆菌固定化细胞及其净化水质的探讨中文摘要长期以来，我国的养殖水体污染严重，主要是氨氮、COD污染，为确保我国水产养殖业的持续发展和水产品质量安全，用微生物治理水体污染受到高度重视，并成为改良养殖水质、缓解环境压力的关键技术，但由于微生物受外界环境影响较大，抗不良环境冲击能力差，一旦系统受损难以恢复，因此处理效果不稳定。而采用固定化微生物技术能克服以上缺点，具有提高降解能力，提升菌体密度，可用于连续反应等优点。本课题以前期实验室筛选的能高效降解氨氮的枯草芽孢杆菌为基础，分别从固定化材料的选择、固定化方法的优化、成品性能测定等方面，对枯草芽孢杆菌的固定化技术开展研究。实验结果表明，选择菌液不离心、养殖水不灭菌的实验条件有利于固定化菌剂发挥降解氨氮的作用。在固定化材料的选择上，琼脂和卡拉胶优于海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇；琼脂固定化枯草芽孢杆菌的最佳制作方法为5%加菌量、2%的材料浓度、4mm的粒径，而卡拉胶固定化枯草芽孢杆菌的最佳制作方法为5%加菌量、2%材料浓度、3mm粒径。用上述优化的固定化方法制成的固定化菌剂在应用于养殖水体时，在1.5天内，其对氨氮的降解率比游离菌分别提高27.5%和35.9%，对COD的降解率分别提高22.5%和27.5%。从使用寿命上看，用琼脂固定枯草芽孢杆菌优于采用卡拉胶，能维持至少2周的降解效果，而卡拉胶制成的固定化小球稳定性差，使用寿命仅为5天。故实验最终确定制备枯草芽孢杆菌固体菌剂的较佳方案是采用优化后的琼脂固定法。关键词：固定化，枯草芽孢杆菌，氨氮Immobilized bacillus subtilis and its purification of waterAbstractFor a long time, Chinas aquaculture water is being serious pollution, mainly is nitrogen, COD pollution, in order to ensure Chinas sustainable aquaculture development and the quality and safety of aquatic products, and using microbiology to control water pollution are highly valued, and become a key technology to improve water quality, ease the pressure on the environment, but because of micro-organisms affected by the external environment, the resistance of adverse environmental impact is poor, once systems is damaged which is difficult to restore, therefore the treatment is instable. Immobilized microorganisms is used to overcome the shortcomings ,which has the ability to enhance degradation and enhance cell density ,and can be used for continuous reaction and so on.Experimental is base to the high-performance degradation of ammonia N of bacillus subtilis which is pre-screened in the laboratory, research the choice of fixed materials, optimizate of fixed methods, test product performance, etc. Bacillus subtilis immobilized is researched. The experimental results show that bacteria is not centrifuged, aquaculture water is not sterilized is good for degrade of ammonia N. In the choice of fixed material, agar and carrageenan is better than sodium alginate, gelatin, polyvinyl alcohol; the best method of making agar immobilized bacillus subtilis is increase in 5% the volume of bacteria, 2% of the material concentration, 4mm diameter, and the best method of making carrageenan immobilized Bacillus subtilis is increase in 5% the volume of bacteria, 2% of the material concentration, 3mm diameter. When use the immobilized bacteria by the above-mentioned method to applied to aquaculture water, In 1.5 days, compare with the free bacteria, the degradation rate of ammonia N were increased by 27.5% and 35.9%, the degradation rate of COD were increased by 22.5 % and 27.5%. In the using life, agar fixed bacteria used longer than carrageenan, which maintain the degradation effect at least two weeks, and carrageenan immobilized ball was poor stability, life is only 5 days. Therefore, the final experiment show that the best fixed preparation of bacillus subtilis way is optimized agar fixed bacteria.Key words: Immobilized, Bacillus subtilis, Ammonia-N27目录第一章 绪论11.1 水产养殖概述11.2 净化养殖水体氨氮和COD的研究进展21.3 微生态制剂概述31.4 微生态制剂在水产养殖应用中存在的问题41.5 微生物固定化细胞的应用情况51.5.1包埋法固定细胞61.5.1.1 海藻酸钠（SA）包埋法61.5.1.2 聚乙烯醇(PVA)包埋法61.5.1.3 明胶包埋法61.5.1.4 卡拉胶包埋法61.5.1.5 琼脂包埋法61.5.2 吸附法固定细胞71.6 发展状况71.7 本课题选题依据71.8 本课题主要研究内容与创新点81.8.1 主要研究内容81.8.2 创新与特色8第二章 材料与方法92.1 主要材料与仪器设备92.1.1 主要材料92.1.1.1 菌种92.1.1.2 水样92.1.1.3 培养基92.1.1.4 主要试剂92.1.2 主要仪器设备92.2 实验方法102.2.1 氨氮标准曲线测定102.2.2 菌种水质净化能力验证102.2.3 离心条件对枯草芽孢杆菌降解氨氮的影响102.2.4 养殖水灭菌对枯草芽孢杆菌降解氨氮的影响112.2.5 不同材料固定化降解氨氮效果比较112.2.6 琼脂固定化枯草芽孢杆菌正交试验112.2.7 卡拉胶固定化枯草芽孢杆菌正交试验112.2.8 最优固定化组合降解氨氮效果追踪试验112.2.9 测定及计算方法122.2.9.1 氨氮的测定：采用纳氏分光光度法122.2.9.2 酸性高锰酸钾法测化学耗氧量COD132.2.9.3 氨氮、COD降解率计算方法14第三章 结果与分析153.1 氨氮标准曲线153.2 枯草芽孢杆菌的水质净化能力验证153.3 离心条件对枯草芽孢杆菌降解氨氮的影响163.4 养殖水灭菌对枯草芽孢杆菌降解氨氮的影响163.5 不同材料固定化降解氨氮效果比较173.6 琼脂固定化枯草芽孢杆菌正交试验183.7 卡拉胶固定化枯草芽孢杆菌正交试验193.8 最优固定化组合降解水质效果追踪试验21结论与展望24致 谢25参考文献26枯草芽孢杆菌固定化细胞及其净化水质的探讨第一章 绪论1.1 水产养殖概述近十多年来，水产养殖业迅速发展，集约式工业化养殖的规模日益扩大。越来越多未处理的养殖废水和工业、生活污水的任意排放使天然水域受到污染，养殖生态环境日趋恶化，导致鱼虾病害频繁发生。目前主要使用广谱抗生素来控制病害的发生，这样过度使用的抗生素药物不仅使病菌的耐药性增强，而且还干扰了养殖环境中有益微生物菌群的正常生长繁殖，破坏了生态平衡，产生二次“污染”；抗生素在生物体内的残留、富集，最终将会对人体构成危害。随着社会的快速发展，越来越多的人开始关注食品的安全，越来越多的人青睐绿色食品。为了适应市场的需求，养殖业开始从传统养殖向绿色养殖发展，因此越来越多的养殖户采用微生物法来改善养殖水体的水质。 在评价水质的多项指标中，氨氮尤为突出。氨氮是水产养殖的水体中化合态氮的两种存在形式，对动物均有较大的毒性。池塘中的氨氮主要来源于三种途径，即水生动物的排泄物、施加的肥料和被微生物菌分解的饲料、粪便及动植物尸体。鱼类可通过鳃和尿液、甲壳类能通过鳃和触角腺向水中排出体内的氨氮，以免发生体内氨中毒。水生动物的粪便及动植物尸体中含有大量蛋白质，被池塘中的微生物菌分解后形成氨基酸，再进一步分解成氨氮。氨氮以两种形式存在于水中，一种是氨（NH3），又叫非离子氨，对水生生物有毒，极易溶于水。另一种是铵（NH4+），又叫离子氨，对水生生物无毒。当氨（NH3）通过鳃进入水生生物体内时，会直接增加水生生物氨氮排泄的负担，氨氮在血液中的浓度升高，血液pH随之相应上升，水生生物体内的多种酶活性受到抑制，并可降低血液的输氧能力，破坏鳃表皮组织，降低血液的携氧能力，导致氧气和废物交换不畅而窒息。此外，水中氨浓度高也影响水对水生生物的渗透性，降低内部离子浓度。氨氮对水生动物的危害有急性和慢性之分。慢性氨氮中毒危害为：摄食降低，生长减慢；组织损伤，降低氧在组织间的输送；鱼和虾均需要与水体进行离子交换（钠、钙等），氨氮过高会增加鳃的通透性，损害鳃的离子交换功能；会使水生生物长期处于应激状态，增加动物对疾病的易感性，降低生长速度；降低生殖能力，减少怀卵量，降低卵的存活力，延迟产卵繁殖。急性氨氮中毒危害为：水生生物表现为亢奋、在水中丧失平衡、抽搐，严重者甚至死亡。Jayasankar等 26研究了氨氮对印度对虾幼体的毒害。结果显示，幼体在急性实验中耐氨氮的能力随幼体发育而增加，无节幼体、蚤状幼体和糠虾幼体的24h NH3-N LC50分别为0.29 , 0.95和3.17mg/L。蚤状幼体48h NH3-N LC50为1.18mg/L。无节幼体发育至仔虾的慢性毒性实验中9d的NH3-N LC50为0.93mg/L；使幼体变态率降低50%的半数效应氨氮浓度EC50为0.25mg/L。幼体培育中氨氮基于LC50的安全浓度应为0.093mg/L，而基于EC50的安全浓度应为0.025mg/L。养殖水体作为人工生态系统，主要依靠投饵和施肥来促进鱼类生长，提高养殖品种产量。在这个特定的生态系统中，存在着物质能量的输入和产出之间的不平衡，投饵和施肥所培育的浮游生物只有部分被鱼类同化吸收，另一部分以代谢产物和残饵的形式直接进入水体。有研究报道28进入水体的鱼类代谢产物(含残饵)占总投饵量的80%左右。集约化养殖水体有机物和氨氮污染尤为严重，其中氨氮高达135.0 mg/L。水中过高的氨氮一方面会对鱼类和其他水生生物产生很强的毒性，它能破坏鳃组织，并渗进血液，降低血液载氧能力，使呼吸机能下降；另一方面，导致营养过剩，产生水体富营养化。据报道，2001年我国海域发生赤潮高达77次，比2000年增加49次。氨氮浓度是评价水环境，特别是养殖用水体质量的重要指标之一。因而，去除水产养殖水体中过多的氨氮对改善养殖环境和保护水资源都有着非常重要的意义。1.2 净化养殖水体氨氮和COD的研究进展在水产养殖生产中，人们控制氨氮污染的传统办法通常是通过换注新水降低氨氮浓度，采用曝气方式使部分氨氮逸出水面，使用余氯消毒去除氨氮，使用氧合器等来调节改善水质等。吴垠等研究了二氧化氯改善养殖水体环境的效果，结果表明二氧化氯能降低水体中氨氮值。成晓云等进行了用膜氧合器排除水产养殖中氨氮的探索，在实验条件下养鱼水经膜式氧合器处理80min后，氨氮去除率可达19.3%。但是这些办法不能使氨氮完全降低到水质要求标准，或受水源制约，对氨氮污染的控制效果并不理想，有时甚至会引起水产动物发病，如鱼类发生气泡病、细菌性鳃病等。因此，探索新的净化养殖水体方法，降解水中的氨氮和亚硝基氮，成为水产养殖业的研究热点之一。近年来，针对降解养殖水体中的氨氮和COD，研究者探索出了一些新的治理方法。包括去除水中的悬浮物、固体废弃物、大型水生生物以及重金属离子；调节水质pH值；增加溶氧，清除有害气体；杀灭致病菌和降解氨氮与COD等。治理方法有物理、化学以及生物技术等多种途径，其中有多种方法对于降解水体中的氨氮和COD有着良好的效果。吸附法是一种能够降解氨氮和COD的有效方法。它是用多孔性的固相物质，如活性炭、硅胶、浮石粉等，吸附水体中的有毒物质(如氨氮、COD)，从而达到降解的目的。电化学也是一种有效的去除氨氮和COD的方法。用电化学法去除水中溶解的COD和氨氮的研究结果表明，COD完全去除的时间和能耗随着传导率的增加而降低，输入电流最大为2A时，耗能最少，pH相对于输入电流和电导率来说几乎没有影响；在酸性条件下有利COD的去除，碱性条件有利于氨的去除，氨的去除速度低于COD的去除速度。臭氧水处理技术是一种较为先进的净化水质方法。臭氧具有很强的氧化性，可以分解一般氧化剂难分解的有机物。因此，用臭氧处理废水，既能够迅速灭除细菌、病毒和氨等有害物质，又能增加水中溶解氧，从而达到净化养殖废水的目的。有资料报道，臭氧在鱼虾养殖中应用效果显著，Jack在19941995年进行13次臭氧水处理试验，其臭氧投放量0. 59 mg/ L，灭菌率可达99. 12%。除了上述物理化学方法以外，利用生物技术来净化水质也是养殖水处理技术中一个重要的途径。微生物脱氮技术在养殖水质控制上的应用非常广泛，并取得了令人瞩目的成就。国内这方面的研究主要集中在光合细菌及芽孢杆菌等在水产养殖水体净化中的应用。邢华利用PSB净化虾池水质，NH4+-N下降77.8。于沛芬等利用PSB固定化技术进行试验表明，固定化PSB在鱼池中除氨氮率达90以上。朱励华等报道,育苗期间投放光合细菌,氨氮由0.18 mg/ L 降为0.06 mg/ L ,硝酸氮降为0。罗勇胜等对光合细菌与芽孢杆菌协同净化养殖水体进行研究，水质净化实验表明,光合细菌对NH4+-N有明显降解效果, 7d平均相对降解率为17.71%;芽孢杆菌对COD有明显降解效果, 7d平均相对降解率为49.88%。而2 种细菌混合时对NH4+-N和COD 的7d平均相对降解率分别达到35.38%和81.05%。微生物在自然界中分布最广、种类最多、数量最大、个体最小，是大自然生态平衡的基础。这些微生物可以直接或间接地作用于水产养殖对象和养殖环境，能很好地分解养殖生物排泄物、残饵以及浮游植物残体等有机物，从而达到净化环境的目的；同时微生物链在水质净化中通过氧化、还原、光合、同化、异化把有机物转变为简单的化合物，保证了水质的正常功能，从而维持了水生生态系统中水生生物、病原、水质间的平衡。现在微生物作为一种生态调节剂，由于具有成本低、收效大等优点已经被广泛的用于治理养殖水质，以达到降低氨氮(NH4+-N)，增加溶解氧(DO)，抑制有害微生物的繁殖，改善养殖生态环境的目的。1.3 微生态制剂概述微生态制剂（Microecological agent）又称微生态调节剂（Microecological modulator）、益生素（Probiotic）等，是指在微生态理论指导下，运用微生态原理，利用对宿主有益无害的活的正常微生物或正常微生物促生长物质经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的用于动物的生物制剂或活菌制剂，通过维持肠道内微生态平衡而发挥作用。微生态制剂能有效补充畜禽肠道内的有益微生物，改善消化道的菌群平衡，迅速提高机体抗病能力、代谢能力和饲料的吸收、利用能力，从而达到防病治病、提高饲料利用率、提高动物生产性能的作用。并且具有无毒、无害、无残留、无污染等优点，克服了抗生素所产生的菌群失调、二重感染和耐药性等缺点1。目前，国内外常用的微生态制剂有光合菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌等, 分别应用于饲料工业添加剂的开发、水产养殖、水质净化、病虫害防治等。这些生态制剂的应用极大地改善了畜牧业、渔业的产品品质，减少或避免了一些副作用较大的农药和抗生素的使用2,3。1.4 微生态制剂在水产养殖应用中存在的问题随着微生态制剂在水产养殖业中的推广应用，人们也逐步发现其在应用上存在不少问题：1 国内部分微生态菌剂质量不稳定，盐度等水体环境因素影响其应用效果；2 应用菌剂多为游离细胞状态，在流水条件下应用，难以有效发挥作用；3 单一菌剂对养殖水体的生物修复存在自身的局限性，如，微生态制剂中特定的有益菌株只能降解特定类型的化学物质，同时有益菌活性受温度和其他环境条件影响，使菌剂无法很好地发挥作用。例如，光合细菌作为常见的微生态制剂，它在改善水质和作为饲料添加剂方面已取得了良好效果，但目前菌剂多为单一菌种，不能满足多种养殖对象和养殖环境的要求，有的光合细菌只能降解水体氨氮，有的则只能降解亚硝基氮；而且光合细菌只能分解小分子物质，无法利用蛋白质、淀粉等大分子物质，因此在应用上还存在不足。近年来研制开发复合型微生物制剂已成为研究方向。复合型微生物制剂多是由两种或多种微生物分别单独培养后再按合适比例混合，少数是由多种微生物按比例共同培养，它是能够充分发挥群体联合作用优势，取得最佳应用效果的一种微生物制剂。如日本比嘉照夫教授于20世纪80年代研制的EM，主要由光合细菌、乳酸菌、放线菌、酵母菌等具有不同生理特性的多种菌群组成，利用有益微生物菌群的各种生理生化作用，分解、合成或转化水中的有害物质，从而调节和净化水质。国内，张庆等（1999）在罗非鱼养殖池中投放以芽孢杆菌为主体的复合微生态制剂后，发现水质条件得到有效改善，低层溶氧明显增加，溶氧增加2倍以上，有效降低氨氮和亚硝酸盐；吴伟等（2001）发现按一定比例组合沼泽红假单胞菌、诺卡氏菌和假丝酵母菌而成的复合菌株其降解养殖水体中有机物质的能力比单一菌株有明显提高；陈秋红等（2004）将由枯草芽孢杆菌、醋酸菌、乳酸菌制成的复合微生态制剂MCB施放到实验室养殖池塘，发现比未施加复合微生态制剂的对照池溶氧含量明显增加，氨氮、亚硝酸盐、硫化物的含量明显下降；张玲华（2004）等应用主要由假单胞菌、芽孢杆菌和硝化细菌组成的复合微生物制剂对养殖水体进行处理，结果表明它能有效降解有机淤泥，抑制有害微生物和有害藻类的繁殖，平衡养殖水体的微生态环境，促进养殖生物健康生长；侯树宇（2004）等以芽孢杆菌和乳酸菌为主体菌，并辅以放线菌组成的微生态复合菌制剂用以对虾养殖中，模拟试验结果表明投加微生态复合菌剂后，试验池6dCODCr去除率高达84.7，迅速矿化有机氮，有效加强硝化-反硝化作用，控制氨氮在一定水平，亚硝基氮去除率高达81.5；吕耀平（2007）在异育银鲫养殖水体中添加主要由沼泽红假单胞菌、酵母菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、硝化细菌、反硝化细菌、氨氧化菌组成的复合微生物制剂，发现其对改良养殖水体作用明显，显著降低氨氮、亚硝基氮、COD，增加溶氧及缓冲pH。但是对于复合微生物制剂的开发和应用，存在着一些问题：如菌种间是否存在拮抗问题；菌种在特定条件下营养、pH、氧化还原电位离子强度和培养温度等不一定是各菌种的最适条件；菌种在不断生长、繁殖过程中，菌种配合的比例随生长速率不等而发生变化，还有经多次繁殖后，必定以最适生长的菌种为优势菌种，从而造成混合菌群中各菌种比例失调，从而影响到应用效果。目前，复合微生物制剂的研究多集中在应用效果上，对大多数混合菌相互关系和作用机制的研究不够深入，在一方面也影响了复合型微生物制剂的开发。因此，对于复合菌剂，选取合适的有益微生物进行组合，研究其培养条件与相互关系的作用机制，是复合微生物制剂开发与应用的重要问题。1.5 微生物固定化细胞的应用情况由于微生物受外界环境影响较大，抗不良环境冲击能力差，一旦系统受损难以恢复, 因此处理效果不稳定。近年来，微生物制剂的固定化成为诸多学者的研究重点。固定化微生物技术是通过化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域，并被高分子材料包埋，使之成为不悬浮于水但仍保持生物活性的生物修复方法。而枯草芽孢杆菌是一种对人畜无害的细菌, 在自然界中分布广泛, 国内外均允许将其用于饲养添加剂。枯草芽孢杆菌在水中增殖后产生的许多胞外酶能把养殖水体和底泥中的淀粉、蛋白质、脂肪等有机质分解, 从而达到降低养殖水体富营养化和减少底泥生成的作用。在分解过程中, 有机物一部分转化为细菌胞体物质, 而大部分被转化为细菌生命活动过程中所需能量, 同时氨气、氮气、二氧化碳等代谢终产物从水中弥散到空气中。通过这种方法, 养殖水体中的氨氮和硝基氮可显著减少4,5,6。而国内外很少有将枯草芽孢杆菌固定化，用以研究其净化水质能力的报道，所以这方面的研究是有必要的。而要将固定化微生物更广泛地用于水产养殖还需要解决以下问题：1开发价廉而自由的载体并提高其使用寿命及重复使用能力； 2多种生物共生的固定化载体的开发；3包埋方式的改进；4 高效固定化微生物体系的研究；5固定化微生物反应器的开发研究；6 固定化微生物颗粒的传质阻力等7。1.5.1包埋法固定细胞 包埋法是将微生物细胞截留在水不容性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中,通过聚合作用,或通过离子网络形式,或通过沉淀作用,或改变溶剂温度、pH使细胞截留。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄漏,同时能让基质渗入和产物扩散出来。包埋材料有天然高分子类和合成高分子化合物2类。天然高分子材料包括:海藻酸钠、卡拉胶、维生素、琼脂、果胶、海藻糖、葡聚糖凝胶、明胶等;合成高分子化合物包括:聚乙烯醇、丙烯酰胺、聚苯乙烯多聚体等8。1.5.1.1 海藻酸钠（SA）包埋法 将菌悬液加入3%海藻酸钠溶液中充分混匀，然后用注射器将其滴入5%浓度的CaCl2溶液中，得到白色小珠，将小珠浸泡在CaCl2中于冰箱内过夜，滤出小珠，洗净备用9。1.5.1.2 聚乙烯醇(PVA)包埋法 将一定量的菌悬液与10%PVA混匀，倒平板，加入饱和硼酸溶液，置冰箱内静置过夜。用刀切成小块状，用无菌水洗净备用。1.5.1.3 明胶包埋法 配置15%明胶悬浮液，加热灭菌后，冷却至35以上，与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，倒入光滑的培养皿中，置冰箱内冷凝2h，取出凝胶，将其浸泡于戊二醛的生理盐水中1.5h，再取出切割成1 - 2mm的颗粒，将凝胶颗粒置于戊二醛生理盐水静置1.5h，滤出备用10。1.5.1.4 卡拉胶包埋法 用生理盐水配制2%卡拉胶溶液，灭菌冷却至45后与适量菌丝混合，冷却凝固后，放入28恒温箱中干燥5h，切成小块，置于2%KCl溶液中硬化过夜。1.5.1.5 琼脂包埋法 将菌悬液与3%琼脂溶液均匀混合，倒平板，冷却凝固，切成小块11。1.5.2 吸附法固定细胞 吸附法是通过静电吸引或利用载体对细胞的亲和性将细胞直接吸附在水不容性载体上的1种固定化方法。吸附有物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法就是通过物理作用将细胞吸附在载体上。许多微生物细胞本身就具有这种吸附能力,这种吸附于载体的天然倾向促使他们比较牢固地“黏”在载体上,从而形成固定化细胞。载体和细胞之间并不发生任何化学方面的作用。某些细胞还具有相互吸附和聚集的倾向,因此,在长时间高浓度培养时,会出现纯的细胞絮凝团,这种絮凝团在一些高剪切力的生物反应器中也相当稳定,不易破碎。因为是纯细胞团,细胞浓度特别高,所以生物转化率也高,这也是1种物理吸附。与物理吸附相比,离子吸附比较牢固,因为离子吸附利用细胞和载体相互间的离子引力或化学键的作用,所以吸附效果较好。 吸附法常用载体根据组成的不同分为有机载体和无机载体。有机载体又分为天然载体和合成载体,在固定化过程中使用的天然载体包括:聚多糖,如纤维素、葡聚糖、琼脂糖;蛋白质,如明胶、胶原蛋白;碳材料,如无烟煤、木材等。合成载体包括:乙烯和马来酸酐的共聚物、戊二醛缩水甲基丙烯酸酯共聚物、合成的离子交换材料及塑料等。无机载体主要包括:玻璃、陶瓷、含水的金属氧化物及硅藻土等12,13。1.6 发展状况 目前，由于固定化细胞技术不够成熟，在固定化细胞的包埋材料的有无毒性及某性能，固定化细胞的强度及无杂菌性等方面还存在不足，固定化细胞技术主要用于污水处理。要将固定化技术更好地用于生产食品，药品等方面，就必需研究出更多更好的无毒价廉的包埋材料，不断探索出提高固定化细胞强度的方法。现在，在这些方面已取得一定进展，在有些领域已将固定化技术应用于工业生产。随着固定化细胞技术的不断成熟，将更好地服务于更多的领域14。1.7 本课题选题依据目前，利用微生态制剂净化水质的生态养殖已备受人们的广泛关注，但多数是采取直接投加游离菌的方式，这种方式有其弊端,主要表现在以下几个方面: 1游离菌对环境的适应能力差,易大量死亡2游离菌易随养殖水的流动而流失； 3游离菌易被水中高等微生物捕食。使用固定化微生物可以克服上述缺点，此外,固定化微生物还有如下优点: 1固定化颗粒里面生物量浓度高,能使微生物稳定高效的发挥作用；2固定化菌可以长时间多次利用；3固定化微生物抗毒性能和耐受力比游离菌明显增强。因此，固定化菌在养殖废水处理方面有广阔的应用前景15,16。本课题在前期实验室选育出具有高效降解氨氮功能的枯草芽孢杆菌的基础上，对其细胞的固定化方法进行优化，使其更好地应用于水产养殖的水质净化处理。1.8 本课题主要研究内容与创新点1.8.1 主要研究内容 1 固定化细胞的制备：采用不同的包埋材料和技术，对枯草芽孢杆菌进行固定化处理，测定固定化后的枯草芽孢杆菌降解养殖水体氨氮与COD能力，并以游离菌体的净化效果作对照，优化较佳的菌体细固定化技术。 2 固定化细胞的特性研究：以较佳的细胞固定化技术制备的固定化小球为基础，探讨其小球形态、使用寿命、净化水质效能，以及它们之间存在的相关性。1.8.2 创新与特色本科题以实验室选育保藏的枯草芽孢杆菌菌株为基础，对其进行不同材料的固定化，优化细胞的固定化方法，为研制高效净化水质、能长时间使用的固定化菌剂做基础工作。第二章 材料与方法2.1 主要材料与仪器设备2.1.1 主要材料2.1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌：由微生态制剂中分离获得，氨氮降解率70左右。2.1.1.2 水样 淡水水样：福建农林大学观音湖池塘水。2.1.1.3 培养基1 混合培养基（g/1000ml蒸馏水）酵母膏 3g NaCl 20g葡萄糖 5g 无水乙酸钠 3g硼酸 0.02g 钼酸钠 0.1g硫酸铵 0.3g PH 6.5若为固体，加入琼脂20g，121下灭菌20min。2 养殖水培养基取福建农林大学观音湖池塘水，静置后使用，控制氨氮浓度为10mg/l,PH为6.5。2.1.1.4 主要试剂碘化汞（分析纯）、黄胺（分析纯）、碘化钾（分析纯）、硫酸锰、NaOH（分析纯）、酒石酸钾钠（分析纯）、琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、聚乙烯醇、CaCl2、戊二醛、KCl、硼酸、酵母膏、NaCl、葡萄糖、无水乙酸钠、钼酸钠、硫酸铵等。2.1.2 主要仪器设备超净工作台（SPDJ型，上海浦东物理光学仪器厂）；高压蒸汽灭菌锅（YXOSG41280型，上海医用核子仪器厂）；隔水式恒温培养箱（GNP-9080型，上海精密实验设备有限公司）；生化培养箱（LRH-190型，广东省医疗器械厂）；IKA迷你振荡器（MS1型，上海人和科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（DK-S24型，上海精宏实验设备有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9053A型，上海精密实验设备有限公司）；可见分光光度计（SP-1105型，上海光谱仪器有限公司）；高速台式离心机（TGL-16C型，上海安亭科学仪器厂）；台面式pH/ISE测试仪（868型，美国ORION公司）；电子天平（BL150型，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；移液枪（2001000l，10005000l型，上海大龙医疗设备有限公司）。2.2 实验方法2.2.1 氨氮标准曲线测定吸取0、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00和10.0ml铵标准使用液于50ml容量瓶中，加无氨水至标线，加1.0ml酒石酸钾钠溶液，混匀。加1.5ml纳氏试剂，混匀。放置10min后，在波长420nm处，用光程20mm比色皿，以无氨水为参比，测量吸光度。由测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，得到校正吸光度，绘制以氨氮含量（mg）对校正吸光度的标准曲线。2.2.2 菌种水质净化能力验证在前期研究的基础上，实验组是将枯草芽孢杆菌接种于混合培养基中，置于30、100r/min摇床下培养24h，后将菌种作为活菌制剂，以5接种量接种于未灭菌100ml养殖水中，置于30、100r/min摇床下培养，跟踪测定氨氮降解率；对照组是不加枯草芽孢杆菌的养殖水，其他实验条件与实验组相同。实验以氨氮的降解率为衡量指标，验证菌种降解氨氮的能力。2.2.3 离心条件对枯草芽孢杆菌降解氨氮的影响 1 将10ml菌液放入离心管中，以10000rmb离心出0.1g湿菌体，分成两份，各为0.05g,一份湿菌体固定在25ml的3%海藻酸钠中，再加入到未灭菌100ml养殖水中；另一份湿菌体直接加入到未灭菌100ml养殖水中；均置于30、100r/min摇床下培养，测定两份养殖水中的氨氮浓度变化情况。 2 将10ml菌液分成两份，一份固定在25ml的3%海藻酸钠中，再加入到未灭菌100ml养殖水中；另一份直接加入到未灭菌100ml养殖水中；均置于30、100r/min摇床下培养，测定两份养殖水中的氨氮浓度变化情况。2.2.4 养殖水灭菌对枯草芽孢杆菌降解氨氮的影响 实验组是将5ml的菌液固定化于3%的琼脂中，分别加入到灭菌和未灭菌的100ml养殖水中，置于30、100r/min摇床下培养，测定氨氮降解率；对照组是不加任何东西的养殖水，也置于30、100r/min摇床下培养，测定氨氮降解率，其他条件与实验组相同，以研究原养殖水中的生物是否会对实验造成影响。2.2.5 不同材料固定化降解氨氮效果比较实验组分为两组：1第一组是将5ml的菌液分别固定在海藻酸钠、琼脂、明胶、聚乙烯醇、卡拉胶上，并投入100ml养殖水中，置于30、100r/min摇床下培养（培养条件下同），；2第二组是只将固定化材料分别加入到100ml养殖水中，置于30、100r/min摇床下培养，跟踪测定氨氮的降解情况。而对照组分为游离菌液对照与培养基对照。其中，游离菌液对照是将5ml菌液直接加入到100ml养殖水中，置于30、100r/min摇床下培养，测定氨氮降解率，用以比较不同材料固定化菌液后提高降解率的优劣程度；而培养基对照是只有空白的养殖水，也置于30、100r/min摇床下培养，测定氨氮浓度的变化情况，从而研究养殖水中氨氮的稳定性。2.2.6 琼脂固定化枯草芽孢杆菌正交试验采用正交方法，探讨不同菌液量、琼脂浓度、固定化的粒径对水质净化的影响，通过测定培养36h的氨氮降解率，确定采用琼脂作为固定化材料的固定化方法。2.2.7 卡拉胶固定化枯草芽孢杆菌正交试验用正交方法，探讨不同菌液量、卡拉胶浓度、固定化的粒径对水质净化的影响，通过测定培养24h的氨氮降解率，确定采用卡拉胶作为固定化材料的固定化方法。2.2.8 最优固定化组合降解氨氮效果追踪试验将根据上述优化的两种固定化方法所制成的固定化细胞，放置到200ml养殖水中,跟踪测定两周内的氨氮降解率变化情况。同时以只加10ml游离菌液和不加菌液的培养基作为对照，以研究两种固定化方法处理的菌剂的降解效果，同时探讨两种固定化方法制成的菌剂的使用寿命。2.2.9 测定及计算方法2.2.9.1 氨氮的测定：采用纳氏分光光度法原理：以游离态的氨或铁离子等形式存在的铵氮与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物，该络合物的色度与铵氮的含量成正比，可用目视比色或者用分光光度法测定。1 试剂配制纳氏试剂：称取16g氢氧化钠(NaOH) ，溶于50mL水中冷至室温。称取7g碘化钾(KI)和10g