凝集素受体在围植入期小鼠输卵管粘膜的分布状况.doc

凝集素受体在围植入期小鼠输卵管粘膜的分布状况【摘要】目的：研究围植入期小鼠输卵管粘膜凝集素受体的分布特点和变化规律。方法：以生物素标记的凝集素ECL、UEA和PHAL为探针，应用亲和细胞化学和图像分析的方法，检测上述3种凝集素相应受体的分布状况和变化规律。结果：3种凝集素受体均存在于小鼠围植入期输卵管粘膜内，但数量和变化规律存在差异。ECL和PHAL受体水平在动情期高于动情间期，孕期呈现先下降后上升的趋势，且在孕4、孕5?d的水平显著低于动情间期和动情期（P0.01）。动情间期UEA受体水平明显高于动情期和孕期（P0.01）。结论：围植入期ECL和PHAL受体表达下降，在输卵管内形成了不利于植入的微环境，可能是胚泡正常情况下不植入输卵管的原因之一；动情期UEA受体水平显著低于动情间期，有利于受精过程的正常进行。 【关键词】 植入 输卵管 凝集素受体 小鼠 A(Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China) ABSTRACT Objective: To explore the distribution pattern and dynamic changes of lectin receptors in the mucosa of the mouse oviduct during the periimplantation period. Methods: Using biotin labeled ECL, UEA and PHAL as probes, the distribution and dynamic changes of their receptors we reexamined by affinity cytochemistry and image analysis. Results: The receptors of ECL, UEA and PHAL all existed in the mouse oviduct, but their levels and distribution patterns were different. The level of the ECL and the PHAL receptors were higher at the estrus than at diestrus. ECL and PHAL receptors maintained a lower level at day 4 and 5 of pregnancy than those at the diestrus. The level of the UEA receptor at diestrus was much higher than that at estrus and that of pregnancy. Conclusion: During periimplantation, the decrease of the ECL and the PHAL receptors may lead to the failure of implantation in the oviduct, and the increase of the UEA receptors at diestrus may contribute to the process of fertilization. KEY WORDS Implantation; Oviduct; Lectin receptor; Mouse 输卵管是雌激素、孕激素的靶器官，生殖周期中其粘膜上皮细胞表面的糖复合物可发生周期性变化1，2，凝集素受体是这些糖复合物中的一类。本实验以昆明小鼠为研究对象，对围植入期输卵管粘膜凝集素受体进行定位和定性研究，以期了解围植入期输卵管粘膜凝集素受体的分布特点和变化规律。 1 材料与方法 1.1 动物和试剂 健康育龄期未经产雌性昆明小鼠42只，体重25 30?g，由山东大学实验动物中心提供。 生物素标记的鸡冠珊瑚树凝集素（ECL）、荆豆凝集素(UEA)、菜豆凝集素L (PHAL)均由北京中山生物技术有限公司提供，复合消化液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素(SP)、多聚赖氨酸均由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1.2 动物分组 随机分为7组：第1组为动情间期组，第2组为动情期组，第3 7组分别为妊娠第2、4、5、6和8?d组，每组均为6只。以阴道脱落细胞涂片确定动情间期和动情期；将动情期雌性小鼠于傍晚与成熟雄性小鼠21合笼，次日晨查见阴栓者定为妊娠第1?d，以此类推确定妊娠天数。 1.3 亲和细胞化学染色 常规脱蜡、水化，3%H2O2/甲醇灭活内源性过氧化物酶，滴加生物素标记的凝集素(1200),37?孵育1?h，清洗后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素（1100），37?孵育1?h，DAB/H2O2室温避光显色。阳性部位呈棕黄色，根据着色深浅，将着色强度分为强阳性（+）、阳性（+）、弱阳性（+）和阴性（-）。 1.4 统计学处理 将亲合细胞化学染色标本图像输入图像分析仪（IMAGEPRO PLUS），分别测各期输卵管粘膜中阳性染色部位的平均光密度（OD），并绘出直方图；应用t检验对各组平均光密度进行统计分析。 2 结 果 2.1 ECL亲合细胞化学染色和图像分析结果 各组阳性着色主要见于输卵管粘膜游离缘，高倍镜下可见着色部位主要位于细胞表面的纤毛或微绒毛，部分上皮细胞内亦有弱阳性着色。动情间期组着色强度多为阳性（），动情期组阳性部位着色明显增强（），见图1。孕4、孕5?d着色强度明显低于动情期（P0.01）,见图2。孕期各组阳性部位着色强度呈现先下降后上升的趋势,见图3。 22 UEA亲合细胞化学染色和图像分析结果 UEA阳性着色部位与ECL大致相仿，主要见于输卵管粘膜上皮的游离缘。动情间期组着色部位多为阳性（ 2.3 PHAL亲合细胞化学染色结果 阳性着色部位与ECL大致相仿，主要分布于输卵管粘膜上皮的游离缘。动情间期组着色部位多呈阳性（3 讨 论 凝集素是一类具有与多糖复合物中特异糖基专一结合能力的蛋白质或糖蛋白，因而常被用作探针来研究细胞表面糖复合物中的糖结构及分布情况。凝集素受体是指细胞表面的糖蛋白或糖脂，具有能被凝集素特异识别的糖基，参与了生殖过程的多个环节。 输卵管对于卵子的接纳和运行、精子获能、受精、受精卵的分裂和输送等具有重要作用。异常情况下，胚泡有异位植入输卵管的可能，并伴有糖复合物的改变，凝集素受体即是这些糖复合物中的一类。 在动情期，小鼠体内雌激素水平增高，输卵管粘膜上皮代谢水平随之升高，上皮细胞呈功能活跃状态，纤毛摆动加速以推动卵子向子宫移动。本研究结果显示，动情期ECL和PHAL的受体水平高于动情间期，提示高水平的雌激素可能上调这两种凝集素受体在输卵管粘膜的表达。值得注意的是，动情期UEA受体的表达水平却明显低于动情间期。Shalgi等3，4报道，UEA特异性结合的糖基为L岩藻糖，而 L岩藻糖对受精有抑制作用。因此，雌性小鼠在动情期交配后，UEA受体表达水平降低显然有利于精子与卵细胞在输卵管壶腹部结合为受精卵，此结果与袁华等5学者以大鼠为研究对象所得结论一致。 Misoge等6认为，滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞表面糖链的相互识别可能在胚泡与子宫内膜粘附及植入过程中发挥重要作用，当囊胚植入时，滋养层细胞的低聚糖受体与子宫内膜上皮细胞表面的糖链进行识别而引起粘附，从而引发植入过程。Sutherland等7的研究结果也表明，子宫内膜糖蛋白介导胚泡和子宫内膜上皮的粘附。本实验室相关实验也表明8，ECL、PHAL受体与胚泡植入高度相关，它们在围植入期均呈现先升高后下降的趋势，大约在孕4、5、6天达到峰值，此时正是胚泡进入子宫腔与子宫内膜细胞表面糖链进行识别并引起粘附的关键时期。而本实验结果表明，早孕期输卵管粘膜的ECL、 PHAL受体均呈现先下降而后上升的趋势，于孕5天左右表达量最低，与该两种凝集素受体在子宫内膜的表达模式正好相反。这提示输卵管的ECL和 PHAL受体水平的显著下降，将会造成胚泡与输卵管粘膜的相互识别和粘附障碍，在输卵管内形成不利于植入的微环境。因此我们推测，即便受精卵输送异常而致使其在输卵管内滞留并能够发育到胚泡期，也不容易在输卵管内植入。 王晗等9认为，子宫内膜上皮细胞表面的岩藻糖化抗原在胚泡植入过程中可能发挥重要作用。本实验输卵管的染色结果显示，UEA受体水平在动情期和早孕期均呈现低水平表达。这可能会破坏胚泡与输卵管粘膜之间的相互识别和粘附，从而阻止植入的发生。由此我们认为，在动情周期中输卵管粘膜UEA受体的变化有利于输卵管的功能活动。【参考文献】 1罗善云, 孟运莲, 刘少阳. 输卵管生殖生理与临床M. 湖北:武汉大学出版社, 2003.710.2Lee MC, Wu TC, Wan YJ, et al. Pregnancyrelated changes in the mouse oviduct and uterus revealed by differential binding of fluoresceinated lectinsJ.Histochemistry, 1983, 79(3):365375.3Shalgi R, Raz T. The role of carbohydrate residues in mammalian fertilizationJ. Histol Histopathol, 1997, 12(3):813822.4EkhlasiHundrieser M,Gohr K, Wagner A, et al. Spermadhesin AQN1 is a candidate receptor molecule involved in the formation of the oviductal sperm reservoir in the pigJ. Biology of Reproduction, 2005, 73(5):536545.5袁华，孟运莲，周新华，等. 动情周期中大鼠输卵管上皮凝集素受体的研究J.中国组织化学与细胞化学杂志,1997,6（4）：388390.6Miosge N, Dresp W, Herken R. Ultrastructural localization of binding sites for the lectins RCAI, WGA and LTA in preimplantation mouse embryoJ. J Histochem Cytochem, 1997, 45(3):447453.7Sutherland AE, Calarco PG, Damsky CH. Expression and function of cell surface extracellular matrix receptors in mouse blastoc