卵巢摘除对急性肝损模型鼠脑血管内皮细胞凋亡的影响.doc

卵巢摘除对急性肝损模型鼠脑血管内皮细胞凋亡的影响【摘要】目的研究卵巢摘除对于急性肝损伤模型鼠脑血管内皮细胞功能的影响。方法对去势(卵巢摘除)与未去势小鼠分别给与四氯化碳制备急性肝损伤模型，另设单纯卵巢摘除组及空白对照组;免疫组织化学法观察各组小鼠脑血管内皮细胞Bax及Bcl-2的表达。结果发现各组小鼠嗅脑及皮层等脑区毛细血管内皮细胞Bax阳性表达结果类似;而Bcl-2表达存在明显差异，急性肝损伤组嗅脑及皮层等各脑区毛细血管内皮细胞Bcl-2阳性表达呈强阳性;而去势+急性肝损伤组各脑区Bcl-2的阳性表达均偏弱。结论卵巢摘除或卵巢功能退化会影响脑血管内皮细胞应对化学毒性损伤时的抗凋亡功能，从另一个侧面揭示了卵巢相关激素的脑保护作用。 【关键词】 卵巢摘除;急性肝损;血管内皮;细胞;凋亡卵巢是女性重要的内分泌腺体之一，其分泌的雌孕激素与女性体内300多个激素受体密切相关，对机体生理功能调节、维持女性内分泌系统平衡具有重要作用1。卵巢功能紊乱，会导致激素分泌、排卵或黄体形成发生异常，对女的生殖生理会产生一系列影响。目前研究表明卵巢功能退化引发的体内激素水平变化可能是引发女性高血压、糖尿病及神经系统相关病症(如记忆力减退、早老性痴呆等)的重要诱因之一2-3。本研究对去势与普通小鼠分别给予四氯化碳制备急性肝损伤模型，免疫组织化学法观察模型小鼠脑血管内皮细胞Bax及Bcl-2的表达，希望 能从细胞分子层面解释在机体遭受化学损伤情况下，雌激素等卵巢相关激素所发挥的脑血管内皮细胞保护机制。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物健康的irk品系雌性小白鼠(202)g，购自宁夏医科大学实验动物中心，取回后清洁级饲养，自由采食和饮水。irk小鼠分为4组：空白对照组与卵巢摘除组各10只，急性肝损伤组17只，卵巢摘除+急性肝损伤组13只。卵巢摘除组与卵巢摘除+急性肝损伤组行卵巢摘除术，术程顺利。2周后急性肝损伤组与卵巢摘除+急性肝损伤组均给予0.25%四氯化碳橄榄油0.1mL/10g，腹腔注射。注射后24h取材。1.1.2主要试剂鼠抗人Bax单克隆抗体 (可用于小鼠组织Bax检测)， 兔抗鼠Bcl-2蛋白多抗， 羊抗小鼠IgG二抗，羊抗兔IgG二抗，华美生物工程公司分装;四盐酸3,3′-二氨基联苯胺(DAB)， Sigma 公司;蔗糖、过氧化氢酶，北京化学试剂公司。1.1.3主要仪器德国MICROM HM525冰冻切片机;普通光学显微镜，重庆光学仪器有限公司产品;Sarto rius AA 2160 型电子读数分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。1.2小鼠脑组织的采集及脑组织切片的制备各实验组小鼠依次腹腔注射60 g?L-1水合氯醛，麻醉剂量5 mL?kg-1。立即取脑组织放入40 g?L-1多聚甲醛固定液进行固定、保存。将固定好的irk鼠脑组织用流动自来水冲洗约12 h，再入100、200及300 g?L-1的蔗糖溶液脱水沉底，后修块。重点保留嗅脑、前脑及皮层等脑区，进行冰冻切片，所得切片入0.1 mol?L-1PB缓冲液(pH 7.4)清洗3次，每次510 min，备用。1.3小鼠脑组织切片的免疫组织化学染色观察采取二步法免疫组化法，分别滴加Bax及Bcl-2一抗，随后滴加羊抗小鼠IgG二抗，羊抗兔IgG二抗，应用DAB显色。反应进行足够时间后，及时用0.1 mol?L-1 PB缓冲液(pH 7.4)清洗3次，每次510 min。之后贴片，风干后封片观察。2结果2.1小鼠各脑区脑血管内皮细胞Bax的阳性表达与分布Bax免疫组化的实验结果可以看出，空白对照组、卵巢摘除组、急性肝损伤组与卵巢摘除+急性肝损伤组的血管内皮细胞在嗅脑、皮层等各个脑区均有Bax 较强的阳性表达，且差异无统计学意义，见图1(封3)、图2(封4)。2.2小鼠各脑区血管内皮细胞Bcl-2的阳性表达与分布Bcl-2的免疫组化结果显示急性肝损伤组在皮层、嗅脑等脑区毛细血管均呈较强阳性表达，且阳性细胞分布的密度较大(见图3A1、A2，图4A1、A2见封4)，而卵巢摘除+急性肝损伤组在嗅脑、皮层等各个脑区毛细血管则呈Bcl-2弱阳性表达，且阳性细胞的染色强度及分布密度都与急性肝损伤组差异显著(见图3C1、C2，图4C1、C2见封4)。空白对照组与单纯卵巢摘除组相比较，小鼠的嗅脑、皮层等脑区毛细血管内皮细胞Bcl-2阳性表达较高，但染色强度及分布密度的差异尚不够显著(见图3B1、B2、D1、D2，图4B1、B2、D1、D2见封4)。3讨论卵巢负责调节女性的性周期及生殖功能，而卵巢本身又受垂体和下丘脑的调控。下丘脑、垂体、性腺轴之间以正、负反馈调节为基础形成了一个不可分割的功能单位。通常小鼠进行卵巢摘除后，机体的雌激素会急剧下降，在去势2周后其体内雌激素水平已接近零。有前期研究表明卵巢摘除2周后，通过腹腔注射四氯化碳所致的24h急性肝损伤模型鼠的肝损伤情况远严重于卵巢未摘除组4。这与已往雌激素对大鼠肝缺血再灌注损伤具有明显保护作用的研究结果是一致的。由于卵巢、垂体、下丘脑之间存在的负反馈调节，所以卵巢功能的退化或摘除会直接影响体内诸多性激素相关受体功能的发挥，从而影响机体的其它生理功能5。关于卵巢功能紊乱及退化间接引发的脑损伤已有确切的报道6-7，但相关的细胞分子机制并不明确。赵承军等8的研究表明卵巢摘除组小鼠大脑中枢部分神经元突触丧失，使得神经元结构不完整，相关脑区突触密度降低。这一研究从微观上很好的阐明了卵巢摘除对中枢神经系统的影响。之外，关于卵巢摘除对中枢神经系统的影响已经有较多的报道9-11，本实验中Bax免疫组化结果显示空白对照组、卵巢摘除组、急性肝损伤组与卵巢摘除+急性肝损伤组其血管内皮细胞在皮层、嗅脑等脑区均有Bax较强的阳性表达，且表达强度两组间差别无统计学意义。而Bcl-2的免疫组化结果显示卵巢摘除组脑区Bcl-2的表达略弱于空白对照组，表明卵巢摘除2周后，雌激素水平的降低会影响神经元Bcl-2的表达，但实验结果显示两组之间差异无统计学意义。卵巢摘除+急性肝损伤组相比于急性肝损伤组血管内皮细胞Bcl-2的阳性表达在皮层、嗅脑等脑区明显减弱;而空白对照组小鼠相关脑区Bcl-2呈强阳性表达，阳性细胞的染色强度及分布密度都与卵巢摘除+急性肝损伤组构成较明显差异，推测在遭遇相同化学损伤时卵巢未摘除的急性肝损伤组小鼠，体内正常水平的雌激素通过上调神经组织中Bcl-2的表达，使其脑血管内皮细胞抗凋亡能力得以增强，而卵巢摘除+急性肝损伤组的小鼠脑血管内皮细胞因为缺乏雌激素对Bcl-2表达的上调而易于凋亡。雌激素及雌激素受体在心血管系统所具有的重要调节作用之前已得到证实12-14，我们的实验结果更加详尽的表明了在机体遭受化学损伤情况下，雌激素等卵巢相关激素发挥脑血管内皮细胞保护作用的发生机制，很好的解释了由于卵巢摘除引发的血管内皮细胞在遭受外来侵害因素下易凋亡的原因。最近O’Lone R 等的实验又进一步表明了雌激素受体α和β能够调解不同途径血管内皮细胞的基因表达，包括线粒体电子传递和活性氧的生成有关的基因的表达15，这些研究提示我们雌激素及其它性激素的功能不仅仅局限于生殖方面，而是具有更为广泛的生理作用及调节机制。随着研究目的的深入和方法的改进，我们期待对于卵巢及雌激素功能有更全面和深入的了解，以期更好的阐明女性卵巢功能紊乱和退化对女性生理健康及神经系统的影响。【参考文献】 1Knofer L，Markus W，Angele K，et al. Preservation of splenicimmune functions by female sex hormones after trauma-hemor-rhageJ.Critical Care Medicine， 2002,30(4) ：888-893.2Zeng Jin-xiong. The Experiment of Qiang-shen-gu-ben Capsule on Reproductive Endocrine and Sport Ability in Male RatsJ. Biochim Biophys Acta,2001， 11(3)：45-47.3Shimizu I. Impact of oestrogens on the progression of liver diseaseJ. Liver Int， 2003， 23(1)： 63-69.4李定国 刘清华.雌激素与肝纤维化研究现状J. 国外医学：消化系疾病分册，2004,24(4)：195-197.5James W Simpkins， ShaoHua Yang， Saumyendra N. Estrogen Actions on Mitochondria-Physiological and Pathological ImplicationsJ. Mol Cell Endocrinol,2008,290(1-2)： 51-59.6Ascenzi P， Bocedi A， Marino M. Structure-function relationship of estrogen receptor alpha and beta： impact on human healthJ.Mol Aspects Med， 2006,27：299-402.7Alkayed NJ， Harukuni I， Kimes AS， et al. Gender-linked brain injury in experimentalJ.Stroke， 1998,29 (1) ：159-169.8ZHAO Cheng-jun; KONG Bin; ZHANG Yan. Observation on Ultrastructure of Hippocamp Neuron of Self-freezing Ovary Transplanting in Castrate MouseJ. Journal of Ningxia Medical College， 2008(1)：22-26.9霍龙伟， 张建生， 王小强.雌激素对大鼠颅脑创伤后脑组织伤区Bcl-2和Bax表达的影响J.中国实用医药，2010,5(15)：34-39.10陈小武， 祝善乐， 范玉华，等. 雌激素对卵巢摘除大鼠心内神经节细胞Bcl-2和Bax表达的影响J.神经解剖学杂志，2004,20(5)：77-82.11杨振军，薛景凤，冯佩明. 雌激素对慢性脑缺血大鼠海马神经元的保护作用J. 解剖学杂志，2010(2)：11-16.12Arya R， Mallik M， Lakhotia SC. Heat shock genes - integrating cell survival and deathJ.J Biosci， 2007,32：595-610.13Neupert W， Herrmann JM. Translocation of proteins into mitochondriaJ. Annu Rev Biochem， 2007,76：723-749.14Psarra AMG， Sekeris CE. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria： regulatory molecules in a new environmentJ.Biochim Biophys Acta,2008,17(83)：1-11.15OLone R， Knorr K， Jaffe IZ，et al. Estrogen receptors alpha and beta mediate distinct pathways of vascular gene expression， including genes involved in mitochondrial electron transport an