基于RNAscope原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析.doc

基于RNAscope原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析 中国预防兽医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine第41卷第1期2019年1月Vol.41，No.1Jan.2019doi10.3969/j.issn.1008-0589.201804021基于RNAscopeR原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析马泽林，张永莉，刘强，胡守萍，张卓，何希君*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)摘要为扩大RNAscope R原位杂交技术(RNAscope RISH)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基础研究中的应用范围，本研究将该技术与免疫组织化学技术(IHC)相结合，通过条件优化建立了RNAscope RISH-IHC双重染色技术。 经检测不同病毒感染的组织切片中的PRRSV表明该技术具有良好的特异性。 采用该双重染色技术检测PRRSV感染的猪淋巴结组织切片中巨噬细胞感染PRRSV情况，结果显示PRRSV核酸主要存在于巨噬细胞胞浆中，在胞核中也有分布，但在一些非巨噬细胞中也散在PRRSV阳性信号，表明PRRSV不仅在猪淋巴结巨噬细胞中复制。 利用该双重染色技术检测PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中凋亡相关调节基因Bid、Bcl-xl表达水平，结果显示一段时间内Bid基因转录水平上调、Bcl-xl基因转录水平下调，与同条件下荧光定量PCR结果一致。 综上，本研究建立的RNAscope RISH-IHC双重染色技术结合了RNAscope RISH与IHC各自的优势，不仅能够检测病毒感染后在组织中的定位，还可以分析病毒感染后宿主内源性基因转录的变化趋势，实现了在同一组织切片中对核酸与蛋白的双重检测。 经验证该检测方法适用于PRRSV实验室研究，为PRRSV的相关基础研究提供新的检测手段。 关键词RNAscopeR原位杂交；免疫组织化学；细胞凋亡；猪繁殖与呼吸综合征病毒S852.65A1008-0589 (2019)01-0040-06Detection andanalysis ofporcine reproductiveand respiratorysyndromevirus intissue samplesbased onRNAscopeRin situhybridizationMAZe-lin,ZHANGYong-li,LIUQiang,HUShou-ping,ZHANGZhuo,HEXi-jun*(StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)Abstract:ToextendtherangeofRNAscope Rinsitu hybridization(RNAscope RISH)inporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)research,ourstudybinedRNAscope RISH withimmunohistochemistry(IHC)toestablishtheRNAscope RISH-IHCdoublestaining.ThismethodhasgoodspecificityindetectionofPRRSVinCSFVinfectedlungsection,PRVinfectedtonsilsectionandPRRSVinfectedlymphnodesection.ThePRRSVnucleicacidmainlyexistedinmacrophagescytoplasmandafewinmacrophagesnucleus,alittleinendotheliocyteofPRRSVinfectedlymphnode.TheseresultssuggestPRRSV alsoreplicatedinotherkindsofcellsinlymphnodes.Wealsoperformedthisdoublestainingtodetectapoptosis-relatedgeneswiththeprobestargeting Bidor Bcl-xl onthymussectionsthatinfectedindifferenttimeofPRRSV.Resultsshowthesametrendofgenesregulationtotheresultreal-timefluorescentquantitativePCRdetection,indicatingtherealso2018-04-13基金项目中国农业科学院xx年院所长基金-病理学创新性研究平台建设 (161030xx015)作者简介马泽林(1994-)，女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，主要从事兽医病理学相关技术的研究.*通信作者E-mailhexijuncaas.*Correspondingauthorwereexcellenttrend-analysisforthetranscriptionofporcineendogenousgene.Inconclusion,ourresultsdemonstratethatRNAscope RISH-IHCdoublestainingmethodisreliable,andmaybeusefulinveterinaryareasofdiagnosisandresearch.Key words:RNAscope Rinsitu hybridization;immunohistochemistry;apoptosis;porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus原位杂交技术(Insitu hybridization，ISH)是以碱基互补配对为原则，通过检测探针标记物间接检测目的基因序列的一种技术。 RNAscope RISH是一种新的寡聚核苷酸ISH。 该技术具有三大特点独特的双Z形探针设计提高了对降解样本的兼容性；信号放大系统使探针的应用范围显著扩展；高度的背景抑制技术克服了过短序列的非特异性染色。 这些创新技术相结合，确保了该技术的高度敏感性和特异性，并扩大了探针适用范围1。 目前该技术在医学领域中广泛应用，如Liou等利用该技术标记巨噬细胞重要标记因子来区分不同极化状态下的细胞，再通过深入研究揭示了不同极化状态对癌症发生发展的影响2。 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是我国流行较为广泛的动物传染病。 目前针对该病的研究主要集中于致病机制等方面，在研究手段上以分子生物学方法为主，基于组织切片的检测技术较少。 IHC应用广泛，成本较低，是目前常用的一种方法，但其检测的目标是蛋白质，对于抗体有硬性需求，目前仅有几种商品化的PRRSVIHC抗体。 RNAscope RISH检测PRRSV仅需设计合成特异性探针，大大降低了实验材料的需求，扩大了应用范围，但机体的独特机制使核酸的转录、翻译与蛋白表达有一定的差异，因此该方法在检测PRRSV或相关因子时也存在局限性。 建立RNAscope RISH-IHC双重染色技术，将二者的优势结合，不仅可以克服各自的局限性，也可以通过检测PRRSV感染组织中外源基因和宿主蛋白或内源基因与PRRSV蛋白，为PRRSV的研究提供更多实验数据。 针对PRRSV的RNAscope RISH-IHC双重染色技术目前尚未见到相关报道。 为使在组织切片上进行的检测技术在PRRSV研究中提供更多帮助，本研究以PRRSV感染动物组织切片为样本，建立RNAscope RISH-IHC双重染色技术。 继而，根据PRRSV感染诱导细胞发生凋亡这一现象3，以PRRSV感染的胸腺组织切片为例，应用该双重染色技术检测其中Bcl-2家族中的促凋亡基因Bid和抑制凋亡基因Bcl-xl表达量的改变，分析该类基因在PRRSV感染组织发生凋亡过程中的变化等，为该技术在PRRSV基础研究中的应用提供参考。 1材料与方法1.1主要实验材料猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原抗体阴性的21日龄长白猪，设置健康组、PRRSV(HuN4)感染后7d组、PRRSV(HuN4)感染后14d组，取其肺脏、胸腺、淋巴结组织制作石蜡切片，另取猪对应新鲜组织-80冻存备用。 同时采集CSFV感染的淋巴结组织和PRV感染的扁桃体组织制作的石蜡切片。 PRRSVN蛋白免疫组化用单克隆抗体(MAb)SR-30A购自ResearchTechnologyInnovation公司；单核巨噬细胞特异性MAbMac387和兔抗鼠碱性磷酸酶标记二抗购自Abcam公司；ApopTag RPlus InSituApoptosisFluoresceinDetectionKit购自Millipore公司；RNAscope R2.5HDAssay-BROWN检测试剂盒购自AdvancedCellDiagnostics公司；PrimeScriptRRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)、焦碳酸二乙酯、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)粉末、蛋白酶、苏木素染色液、快红显色药片购自Sigma公司；乙酸封闭液、水性封片胶购自博士德生物公司；TRIzol裂解液购自天根生化科技(北京)有限公司。 1.2探针设计及合成由于RNAscope RISH检测的目的序列为mRNA，因此设计探针时要选择高保守区域，本实验中，由于PRRSV的ORF1保守区域有间断性，因此，将GenBank中CH-1a(AY032626.1)马泽林，等.基于RNAscopeR原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析第1期41和HuN4(EF635006.1)两个病毒株的ORF1基因序列进行比对，选择较长保守区域213bp1474bp设计PRRSV特异性探针PPH-1；分别根据GenBank中猪Bid基因(AY521564.1)和猪Bcl-xl基因(AF216205.1)序列设计特异性探针PBid和PBcl-xl、PPH- 1、PBid和PBcl-xl，探针均由美国AdvancedCellDiagnostics公司合成。 由于专利保护原因，探针序列暂不便于公开。 1.3RNAscopeRISH-IHC双重染色技术的建立及优化根据前期实验结果，优化试验流程。 结合RNAscope R2.5HDAssay-BROWN检测试剂盒说明书，优化抗原修复时间(10min20min)、蛋白酶消化时间(20min30min)、DAB处理(浓度0.05%0.15%、显色时间30s5min)等步骤。 优化IHC技术的关键步骤碱性磷酸酶封闭时间(5min15min)、MAb(Mac387或SR30-A)稀释比例(1 100、1 200、1400)、孵育条件(室温或37、30min2h)、兔抗鼠碱性磷酸酶标记IgG稀释比例(1 200、1 400、11000)、孵育条件等步骤，快红显色后苏木素染核，冲洗后封片。 1.4RNAscopeRISH-IHC双重染色技术特异性检测按照优化后的RNAscope RISH-IHC双重染色技术流程操作，应用PRRSV特异性探针PPH-1检测健康猪肺脏组织石蜡切片、感染CSFV的猪淋巴结组织石蜡切片、感染PRV的猪扁桃体组织的石蜡切片以及感染PRRSV的猪肺脏组织石蜡切片中PRRSVORF1基因片段，以评估该方法的特异性。 1.5猪淋巴组织切片中PRRSV ORF1基因片段和巨噬细胞的检测采用PRRSV特异性探针PPH-1，并以单核巨噬细胞特异性MAbMac387(1100)为一抗，利用优化后的双重染色技术检测PRRSV感染后以及健康猪淋巴组织切片中的PRRSVORF1基因片段和巨噬细胞。 1.6PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中凋亡细胞的检测将石蜡包埋的PRRSV感染后不同时间点(感染后 0、7d、14d)以及健康猪胸腺组织切片脱蜡后，采用ApopTag RPlus InSituApopto-sisFluoresceinDetectionKit(TUNEL染色法)检测其中是否有凋亡细胞存在，并分析凋亡细胞的数量变化与PRRSV感染时间长短的关系。 操作按照说明进行。 1.7PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中Bid和Bcl-xl基因转录水平变化将冻存的PRRSV感染后不同时间点(感染后 0、7d、14d)以及健康猪胸腺组织采用TRIzol法提取核酸，反转录后，以荧光定量PCR检测Bid和Bcl-xl核酸的转录水平4。 所用引物见表1。 1.8PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中Bid、Bcl-xl基因和PRRSV N蛋白的检测采用特异性探针PBid和PBcl-xl，以PRRSVMAbSR-30A(1200)为一抗，采用优化后的双重染色技术检测PRRSV感染后不同时间点(感染后 0、7d、14d)以及健康猪胸腺组织切片中的Bid、Bcl-xl基因和PRRSVN蛋白。 2结果2.1RNAscopeRISH-IHC双重染色技术的优化结果结合RNA易降解特性，确定双重染色过程中先进行RNAscope RISH检测再进行IHC检测。 通过实验流程的重复摸索和优化，确定了RNAscope RISH的部分关键步骤20g/mL蛋白酶40孵育20min、0.05%DAB室温避光孵育2min、内源性碱性磷酸酶封闭10min(乙酸法处理)，MAb(Mac387/SR30-A)1:200稀释后37孵育30min，兔抗鼠碱性磷酸酶标记IgG1400稀释后室温孵育1h，经快红显色，苏木素复染后封片。 优化前后效果如图1所示。 表1荧光定量PCR引物Table1PrimersfortheqPCRPrimenamePBid-FPBid-RPBcl-xl-FPBcl-xl-RPrimesequence(5-3)TGGATTCTAAGGTCAGCAACGAGGAAGCCAAACACCAGTAGGAGAGCGTAGACAAGGAGATGTGGTCATTCAGGTAAGTGGCTm()6058Length(bp)814252A条件优化前，组织边界模糊，RNAscope RISH阳性信号染料出现累积，IHC阳性信号无法识别；B优化后，两种方法阳性信号均清晰明显A:Theaumulationofdyebeforeoptimization;B:Thepositivesignalsofeachtechniqueafteroptimization图1RNAscope RISH-IHC双重染色优化结果(400)Fig.1EffectoftheoptimizationinRNAscope RISH-IHC(400)中国预防兽医学报2019年42A BA健康肺脏组织；BCSFV感染的腹股沟淋巴结组织；CPRV感染的扁桃体组织；DPRRSV感染的肺脏组织，箭头示阳性信号A:Healthylung;B:InguinallymphnodeinfectedbyCSFV;C:TonsilinfectedbyPRV;D:LunginfectedbyPRRSV(Arrowspointpositivesignals)图2RNAscope RISH特异性检测结果(400)Fig.2SpecificityoftheRNAscope RISH2.2RNAscopeRISH-IHC双重染色法特异性检测结果在健康肺脏组织和感染CSFV的淋巴结组织、感染PRV的扁桃体组织以及感染PRRSV的肺脏组织石蜡切片中采用RNAscopeR ISH-IHC检测PRRSV核酸与巨噬细胞抗原。 结果显示，仅PRRSV感染的猪肺脏组织石蜡切片出现PRRSV阳性信号，其它均无PRRSV阳性信号(图2)。 表明，该技术具有良好的特异性。 而实验中采用的IHC特异性抗体均为商品化产品，其本身就具有高度特异性(文章没有体现)。 2.3猪淋巴组织切片中PRRSV基因片段和巨噬细胞的检测结果利用建立的RNAscope RISH-IHC双重染色法检测PRRSV感染的猪淋巴结组织切片中的PRRSV核酸和巨噬细胞抗原。 结果显示，在肠系膜淋巴结中，PRRSV阳性信号主要分布于巨噬细胞的细胞浆中(图3A)，但在某些巨噬细胞的细胞核中也有少量阳性信号(图3C)，表明巨噬细胞是PRRSV复制的重要场所；在腹股沟淋巴结中，PRRSV阳性信号不仅出现在实质区的巨噬细胞中，在血管内皮细胞中也有一定数量阳性信号(图3B)，表明PRRSV也能侵入某些非免疫细胞；在颌下淋巴结中，PRRSV阳性信号的主要呈现方式是以淋巴小结为中心，大量阳性信号聚集构成了片状的阳性区域，同时在淋巴小结周围有数量不等的巨噬细胞(图3C)。 对照组结果显示，健康猪淋巴结组织中仅有单核巨噬细胞阳性信号(图3D)。 表明PRRSV感染宿主后，以巨噬细胞为主要靶细胞，通过在巨噬细胞中复制从而达到扩大感染的目的。 2.4PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中凋亡细胞的检测利用TUNEL染色法在PRRSV感染后不同时间点对猪胸腺组织切片中细胞的凋亡进行检测，显微镜下观察可见，随着感染时间的延长，细胞凋亡信号逐渐增多(图5A、5B和5C)。 表明PRRSV感染后能够诱导细胞凋亡，且在一段时间内，细胞凋亡与感染时间成正相关。 2.5PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中Bid和Bcl-xl基因转录水平变化2.4的结果显示，PRRSV感染后7d和14d，猪胸腺组织出现凋亡现象。 对感染后不同时间猪胸腺组织中的Bid和Bcl-xl基因转录水平变化进行荧光定量PCR检测。 结果显示，在感染PRRSV后，促进细胞凋亡的Bid基因转录水平随时间延长有上调趋势，而抑制凋亡的Bcl-xl基因转录水平则呈现下调(图4)。 表明PRRSV感染后，宿主胸腺中部分细胞对凋亡的抑制APRRSV感染的猪肠系膜淋巴结中巨噬细胞信号与PRRSV(棕色)信号在同一位置出现(400)；BPRRSV感染的猪腹股沟淋巴结中可见血管内皮细胞及巨噬细胞(红色)中有PRRSV(棕色)信号出现(200)；CPRRSV感染的猪颌下淋巴结中可见PRRSV(棕色)信号出现在巨噬细胞核(蓝色)中，并在淋巴小结中大量聚积(400)；D健康猪淋巴结组织中仅有巨噬细胞(红色)信号(200)A:Macrophages(red)andPRRSV(brown)overlapinPRRSVinfectedMesentericlymphnodes(400);B:PRRSV(brown)inendotheliocytesandmacrophages(red)ofPRRSVinfectedinguinallymphnodes(200);C:PRRSV(brown)innucleus(blue)ofPRRSVinfectedsubmandibularlymphnodes(400);D:Macrophages(red)onlyinhealthypig(200)图3RNAscope RISH-IHC双重染色检测PRRSV感染后淋巴结组织中PRRSV和巨噬细胞Fig.3DetectionofPRRSVandmacrophagesbytheRNAscope RISH-IHCdouble-staininginPRRSVinfectedlymphnodes马泽林，等.基于RNAscopeR原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析第1期43A BCDA BCDACTUNEL染色法检测胸腺组织感染PRRSV 0、7d、14d后，凋亡细胞(绿色荧光)呈现逐渐增加的趋势；D健康猪胸腺组织中Bid基因阳性信号(棕色)散在分布，无PRRSV阳性(红色)信号；E感染PRRSV7d后，猪胸腺组织中Bid阳性信号(棕色)比健康组织有所增加，同时由于PRRSV感染，可见有PRRSV的N蛋白阳性(红色)信号出现；F感染PRRSV14d后，猪胸腺组织中Bid基因阳性信号大幅增多，PRRSVN蛋白阳性(红色)信号也比感染7d时增多；G健康猪胸腺组织中大量Bcl-xl阳性信号(棕色)出现在胸腺皮质中，无PRRSV阳性信号；H感染PRRSV7d后，猪胸腺组织中Bcl-xl阳性信号较健康胸腺组织略有减少，但PRRSVN蛋白阳性信号出现；I感染PRRSV14d后，猪胸腺组织中Bcl-xl阳性色信号有所减少，PRRSVN蛋白阳性信号增多。 A-C:ThepositivesignalsincreasedinhealthythymusandPRRSVinfectedafter7daysand14days(greenfluorescentsignals);D:Theexpressionof Bid gene(brown)scattereddistributewithoutPRRSVNproteinsignals(red)inhealthythymus;E:Theexpressionof Bid geneinthymusthatinfectedbyPRRSVon7dpi,Bidgene(brown)wasmorethaninhealthythymus,andPRRSVNproteinsignal(red)arised;F:Theexpressionof BidgeneinthymusthatinfectedbyPRRSVon14d,Bidgene(brown)wasmorethanon14dpi,andPRRSVNproteinsignal(red)increased;G:Theexpressionof Bcl-xl inhealthythymus,some Bcl-xl gene(brown)existedincortexwithoutPRRSVNproteinsignals(red);H:Theexpressionof Bcl-xl geneinthymusinfectedbyPRRSVon7dpi,Bcl-xl gene(brown)lessthaninhealthythymus,whilePRRSVNproteinsignal(red)arised;I:Theexpressionof Bcl-xlgeneinthymusinfectedbyPRRSVon14dpi,Bcl-xl gene(brown)clearlyreducedin14dpi,andPRRSVNproteinsignal(red)increased.图5PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中细胞凋亡及Bid，Bcl-xl基因表达的检测(400)Fig.5DetectionoftheapoptotiellsbyTUNELassayandBid,Bcl-xl genesbydouble-staininginPRRSVinfectedthymictissuesection功能受到阻碍，从而发生细胞凋亡。 2.6PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中Bid、Bcl-xl基因和PRRSV N蛋白的检测结果采用RNAscope RISH-IHC双重染色法检测PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中的Bid基因和Bcl-xl基因转录水平。 结果显示，随着PRRSV感染时间的延长，PRRSVN蛋白阳性信号也逐渐增多，在大量细胞中出现(图5E、5F、5H和5I)。 Bid基因阳性信号主要出现在PRRSV直接感染的细胞邻近区域。 与健康猪胸腺组织相比，感染后，该基因表达水平上调(棕色信号增加)，并且随着感染时间的延长，Bid基因在胸腺组织中的表达水平上调，显示为棕色的阳性信号明显增多，这与荧光定量结果一致(图5D、5E和5F)。 Bcl-xl基因(显色为棕色的阳性信号)在大部分胸腺皮质细胞中表达，并且有聚集的现象，但同健康猪的胸腺组织相比该基因的转录水平有所下调，且随着感染时间的延长，该阳性信号逐渐减少(图5G、5H和5I)。 本研究建立的双重染色法检测PRRSV感染后猪胸腺组织中Bid、Bcl-xl基因的变化趋势同荧光定量方法检测PRRSV感染后猪胸腺组织中该两种基因的变化趋势一致，表明该技术在检测病毒感染后猪某些内源性基因的变化趋势分析方面具有一定的可靠性。 3讨论本研究基于RNAscope RISH，经优化建立了RNAscope RISH-IHC双重染色技术，确定了其具体流程。 应用该技术检测猪巨噬细胞中的PRRSV时，显示PRRSV主要存在于胞浆中，部分出现在细胞核中，这一结果证实了侵入淋巴结的PRRSV在巨噬细胞有核酸复制的过程，与之前的研究结果一致5。 有文章报道曾在原代猪动脉血管内皮细胞中成功培养PRRSV6，本实验中在PRRSV感染的猪腹股沟淋巴结中也发现部分PRRSV阳性信号出现在血管内皮细胞中，表明在PRRSV感染宿主过程中，宿主血管内皮细胞也能够为其复制提供场所。 在颌下淋巴结中，PRRSV阳性信号在淋巴小结处呈现片状出图4荧光定量PCR检测感染PRRSV不同时间点猪胸腺组织中Bid及Bcl-xl基因转录水平Fig.4Detectionof Bidand Bcl-xl transcriptionlevelsinPRRSVinfectedthymusbyqPCRns:p0.1*:p0.05中国预防兽医学报2019年44F ol dch an ge432100.5Bcl-xl BidMock14dpi7dpinsnsTUNEL RNAscope-Bid RNAscope-Bcl-xlMock7dpi14dpiABCDEFGHI123456789现，分析是由于淋巴小结为免疫细胞和巨噬细胞共存的场所，而有报道指出在部分免疫细胞中也有PRRSV受体表达3,7-8，因此PRRSV阳性信号在免疫细胞聚集的淋巴小结区域出现少量的聚积。 有研究证实在PRRSV感染猪后，病毒非结构蛋白4(Nsp4)活化内质网应激相关凋亡通路，Nsp10等也能够活化部分凋亡通路，同时调节猪的Bid和Bcl-xl基因表达9。 为进一步了解这一过程，本实验应用RNAscope RISH-IHC双重染色技术检测了PRRSV感染猪后的胸腺组织中内源基因Bid和Bcl-xl的转录水平变化，结果显示PRRSV诱导猪胸腺组织产生细胞凋亡现象，并且随着感染时间的延长，凋亡信号增多。 在这一过程中，促凋亡基因Bid转录水平有上调的趋势，而抑制凋亡基因Bcl-xl的转录水平有下调的趋势，这一结论与荧光定量PCR检测结果相符。 RNAscope RISH-IHC的双重染色技术为PRRSV的检测及相关基础研究提供了新的手段，克服了对于抗体的硬性要求，缩短了实验周期。 但由于该技术依托动物组织切片样本，在切片制备过程中存在客观的样本差异，因此本研究对PRRSV感染后猪胸腺组织中Bid和Bcl-xl基因表达的检测与荧光定量PCR的检测结果相比仅能在Bid和Bcl-xl基因转录的变化趋势上相对应，但无法进行绝对定量数据的比较，从而给实验带来了一定的客观误差。 不可否定的是，在新发疾病和变异病毒株的鉴定、检测和研究中该双重检测技术还是具有实际意义。 本研究建立了RNAscope RISH-IHC的双重染色技术，该技术特异性强、操作简便，能够实现不依赖抗体即可进行相关检测，为研究PRRSV致病机制及相关信号通路提供检测平台及技术手段。 参考文献WangF,FlanaganJ,SuNan,etal.RNAscope:Anovel insituRNAanalysisplatformforformalin-fixed,paraffi