基因工程1.doc

基因工程资料基因工程是将DNA片段插入到质粒、病毒等载体中，形成遗传物质的新组合，然后，转移到宿主细胞中扩增和表达。它包括重组DNA技术、体外DNA突变、体内基因操作以及基因的化学合成等；总之，凡是在基因水平上操作并改变生物遗传性的技术工程统称之为基因工程。基因工程的理论依据1. 不同基因具有相同的物质基础；2. 基因是可切割的；3. 基因是可转移的；4. 多肽与基因之间存在对应关系；5. 遗传密码是通用的；6. 基因可通过复制把遗传自信传递给下一代。理论上的三大发现1.Avery于1934年首次报导了肺炎球菌的转化转化实验；10年后，才公开发表。2.Watson & Crick 提出了DNA结构的双螺旋模型；3.60年代破译了遗传密码，确定了遗传信息的传递方式。技术上的三大发明1. 1970年，在流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中分离纯化了限制性核酸内切酶，为基因工程的诞生奠定了最为重要的技术基础； 2. 1970年，Baltimore和Temin等发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。3. 1973年，Cohen将质粒作为基因工程的载体使用，这是基因工程诞生的第二个技术准备；基因工程的操作包含以下步骤： 1.获得目的基因 2.构造重组 DNA 分子 3.转化或转染 4.表达 5.蛋白质产物的分离纯化简述基因工程的应用。基因文库，系指在一种载体分子中随机地克隆着某种生物、组织、器官或细胞类型的所有的DNA片段而构成的克隆集合体。用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。比较：基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。 cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 构建步骤：1.分离细胞总RNA，然后从中纯化出poly(A) RNA2.mRNA的分离3.合成第一链cDNA4.合成双链cDNA分子置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。自身引导法 合成的单链cDNA 3端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用5.将合成的双链cDNA分子重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入到大肠杆菌细胞增殖。核酸杂交（nucleic acid hybridization），它是指两个互补或部分互补的核酸分子形成稳定的碱基配对杂交体的过程。印迹法（blot）的主要步骤：（1）DNA 用限制性内切酶处理。 （2）DNA 片段混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片段DNA 作为探针，互补结合需要找的基因片段。（5）探针DNA 片段已用放射性元素标记， 使胶片感光后可看出。随机引物（random primer）随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的且带有标记物的DNA探针。 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。PCR，即聚合酶链式反应。是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸(oligonucleotide)片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长。PCR实验的基本步骤如下：（1）反应混合物被加热到94，在该温度下，DNA双螺旋两条链之间的氢键被打断，DNA分子发生变性。（2）混合物被冷却到5070 ，每个分子的两条双链能够在该温度下重新结合，但这种情况不大可能发生，因为混合物中大量的短DNA分子与长链DNA分子在特殊的位点发生退火。这些短的DNA分子被称为引物。（3）接着温度又被升高到了72 。这是Taq DNA聚合酶的最适工作温度。Taq DNA聚合酶延伸引物合成与模板互补的新链。这样与刚开始的两条链相比，我们就有了4条DNA链，实现了一次倍增。（4）接下来温度又被升到94 。双链DNA分子又变性成为单链，于是便开始了第二轮变性退火合成的循环，并随之产生8条DNA链。在重复这一循环达25次后，我们在反应开始时用到的双链DNA分子中就会有一段序列的拷贝数超过5千万。至于是那个区段被扩增完全由退火时引物所处的位置决定的。从细菌培养物中制备全细胞DNA的步骤： （1）培养细胞的生长和收集（harvested）； （2）细胞的破碎及内含物(content)的释放； （3）从细胞抽提物（cell extract）中除去DNA外的其他所有成分； （4）DNA溶液的浓缩(concentrated)。常常使用溶菌酶(lysozyme)或者乙二胺四乙酸盐（EDTA）破坏细胞壁，或者二者结合起来使用。但通常还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）导致细胞膜破裂，协助整个细胞外壁的溶解过程。制备细胞提取物的最后一个步骤是通过离心去除细胞内的不溶性残余物。像部分消化的细胞壁碎片等成分能够通过离心的方式聚集在离心管的底部，而细胞提取物则以上清（supernatant）的形式得到分离。去除蛋白质的标准方法：加入苯酚和氯仿的混合物（11）（phenol / chloroform ）。混合物能够沉淀出蛋白质但仍保留核酸（DNA和RNA）在水溶液中。把细胞提取物和有机溶剂逐渐混合并离心后，沉淀出的蛋白质分子会聚集在水溶液和有机溶剂的界面处形成白色的凝集物。这样一来，水溶液中的核酸分子就能够用吸管分离出来。如果细胞提取物中的蛋白质过多，单用苯酚提取并不足以彻底纯化核酸。这时需要需要在苯酚抽提前，先用蛋白酶（proteinase），比如蛋白酶K，对细胞提取物进行处理，这些酶可以将蛋白质降解为短肽便于进行苯酚的提取。 一些RNA分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过程中被除去，但是绝大多数RNA都和DNA一起保留在水溶液中。最有效的去除RNA的方法是使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子。最常用到的DNA浓缩方法是乙醇沉淀(ethanol precipitation) 。在单价阳离子（如钠离子）存在的条件下，一定浓度的乙醇能够有效地使核酸分子沉淀出来。十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB）法，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里；在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。这样，核酸就能够利用乙醇沉淀进行浓缩，利用核糖核酸酶处理去除RNA。方法之二需要用一种被称为异硫氰酸胍的化合物，这种化合物具备的一些特性对于DNA的纯化十分有用。第一，它能够使除了核酸以外的其他生化成分变性和溶解，因此可以用来从任何组织中分离DNA。第二，在异硫氰酸胍存在的情况下，DNA会牢固地结合在二氧化硅颗粒上。这使得将DNA从变性的生化成分中的分离变得十分简单。二氧化硅被被置于色谱柱中，DNA结合在二氧化硅上被保留在色谱柱中，而其他变性成分随着溶液流出色谱柱。在利用异硫氰酸胍洗掉柱中的杂质后，利用水将DNA从色谱柱中洗脱出来，因为水能够减弱DNA分子与二氧化硅之间的相互作用。碱裂解法提取质粒的原理：质粒DNA通常以超螺旋的形式存在于细胞中。超螺旋是在质粒复制过程中在拓扑异构酶的作用下形成的。超螺旋分子很容易同其他非超螺旋DNA分子相分离，利用这一特点，通过下面两种途径可以从细胞粗提物纯化出质粒DNA。这项技术的基础是在一个窄的pH范围内非超螺旋DNA被变性，而超螺旋DNA不发生变性。如果用氢氧化钠把细胞提取液的pH值调整到12.012.5的范围内，非超螺旋DNA的两条链相互分离。此时，如果加入酸，这些变性的DNA链会杂乱地聚集在一起相互交联，形成的网状物可以通过离心除去，悬液中只剩下纯净的质粒DNA。 这一处理方法的另一个优点是，在某些环境中（尤其是利用SDS溶解细胞以及醋酸盐（sodium acetate ）中和溶液时），绝大多数蛋白质和RNA也变成不容物，并在离心的步骤中被除去。DNA操作酶根据其催化的反应可以分为5大类：（1）核酸酶（nucleases），切开或降解核酸分子。（2）连接酶（ligases），将核酸分子连接起来。（3）聚合酶（polymerases），复制核酸分子的酶。（4）修饰酶（modifying enzyme），去除或添加化学基团的酶。（5）拓扑异构酶（topoisomerases），向共价闭合环状DNA分子中引入或消除超螺旋。外切核酸酶(Exonuclease)，从DNA分子的末端一个一个地切除核苷酸。 （2）内切核酸酶(Endonuclease)，从DNA分子内部打断磷酸二酯键。而内切酶可以在多核苷酸链内的不同位置水解磷酸二酯键。DNA连接酶：可使一段DNA的3 羟基末端和5磷酸末端形成3，5- 磷酸二酯键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形成的切口的酶。1)DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接；2)只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（gap）。Taq DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是从嗜热菌中分离得到的依赖于DNA的DNA聚合酶，首先该酶能在高温下进行DNA的合成工作，其次该酶在新合成的DNA的3末端添加一个A，这有利于将合成的产物克隆到带有T末端的载体中去。为什么在有些克隆载体中要插入噬菌体SP6和T7的启动子序列？SP6和T7启动子是噬菌体基因组中的启动子序列，该启动子只被特异的噬菌体的RNA聚合酶所识别，如SP6的启动子序列只能被SP6噬菌体的RNA聚合酶所识别，这样不但可以进行体外转录获得RNA分子，而且所获得的RNA的序列方向也是可以控制的。通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，统称为DNA修饰酶碱性磷酸酶多核苷酸激酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），催化核酸脱5-磷酸基团，使DNA或RNA片段5-P末端转换成5-OH末端。多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)（从T4噬菌体侵染的大肠杆菌细胞中提取），和碱性磷酸酶的活性相反，在DNA分子5游离末端添加磷酸基团。末端转移酶（terminal transferase）（从小牛胸腺组织中提取），在DNA分子的3末端添加一个或多个脱氧核苷酸。一种不需要模板而催化脱氧核糖核苷酸加到DNA链的3羟基端。HindIII的是一种限制性核酸内切酶，它是这些字母分别代表什么？按酶的来源的属种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字 例如：从流感嗜血杆菌d株(Heamophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶，分别命名为HindI，HindII和HindIII不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶，又称同功异源酶 。不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶用EcoRI和BamHI分别消化一个4.9 Kb的片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分别检测消化片段的大小。请画出该片段的限制性酶切图谱。载体（vector）是在细胞中能够自主复制的分子，通过实验手段可使其他的片段连接在它的上面，并能转移到另一个细胞中而进行复制或表达。作为基因工程的载体，一般应具备以下性能：1、分子较小，可携带比较大的片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 3、尽可能有多种限制酶切位点，但每一种限制酶又要有最少的切割位点。 4、有适合的标记，易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制。 质粒是细胞中染色体外的一种能自我复制的环状双链DNA分子。pBR322的第一个优点在于它的大小。作为一个克隆载体，它应该小于10 Kb，否则在提纯的时候很容易导致DNA断裂。pBR322本身只有4361 bp，这就意味着我们很容易纯化它以及由它构建的重组体。即便添加上6 Kb的DNA片段，pBR322的大小仍在可操作的范围内。pBR322的第二个优点是它有两个抗生素抗性基因。这两个抗药性基因都可以作为该质粒的筛选标志，而且每个抗性基因都拥有几个单酶切位点，这在克隆实验中特别有用第三个优点在于pBR322有相当多的拷贝数。pUC8所拥有的3个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。第一个优点的获得纯属偶然，人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产生了一个偶然的突变，使它在大肠杆菌中的拷贝数达到了500700，这还是它在扩增以前的数目。第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅需要把待筛选的大肠杆菌细胞铺到含有氨苄青霉素和X-gal的琼脂培养基上。第三个优点是pUC8具有众多的单酶切位点，这使有两个不同粘性末端的DNA片段可以直接被克隆。pGEM3Z载体的特点：pGEM3Z与pUC8载体很相似：都含有ampR和lacZ基因，lacZ中有一个多酶切位点，两个质粒的大小也十分相似。它们之间的区别在于，pGEM3Z多了两个短片段，每个片段都含有一个启动子序列，募集RNA聚合酶。外源DNA在限制性酶切位点插入pGEM3Z载体，在限制性酶切位点的两边就分别存在着两个启动子序列。穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。l噬菌体基因组的结构特征：基因图谱的一个特征是功能上相关的一系列基因在基因组中聚集在一起。DNA是一种双链、线性DNA。在分子的两端各有一段短的由12个核苷酸组成的单链序列。这两个单链DNA片段是互补的，称作cos位点。在利用噬菌体构建克隆载体时，必须解决两个难题：（1）噬菌体DNA分子仅能再增加5%，也就是说新增加的DNA长度不能超过3 Kb。一旦DNA的总长度超过了52 Kb，它就不能包装进噬菌体的头部，也就是说不能形成感染性的噬菌体颗粒。这样就制约了插入DNA片段的长度，限制了噬菌体载体的使用。 （2）噬菌体的基因组很大，这使得对于每一种限制性内切酶来说，识别位点都不是单一的。这使我们无法按我们的需要去酶切噬菌体的DNA分子，因为噬菌体DNA会被切成许多小段。解决办法：可以从噬菌体基因组中移除部分片段对噬菌体的分析发现，40的lambda基因组对于噬菌体的溶菌生长是非必需的。这一非必需片段中所包含一些与噬菌体的溶原生长有关的基因。这40的区段可以被外源DNA片段所取代而不影响噬菌体基因组的复制和结构蛋白。可以用自然选择来筛选那些缺少酶切位点的噬菌体比如将噬菌体感染到具有EcoR I限制-修饰体系的和不具有EcoR I限制-修饰体系的两者宿主细胞中循环生长。用未经修饰的噬菌体感染具有EcoR I限制修饰体系的宿主细胞，那么其子代噬菌体颗粒的产量便会剧烈地减少，为数不多的幸存者，是来源于在感染早期已经发生了修饰作用的DNA，所以它们可以抵御EcoR I限制修饰体系的作用。此外，它们也可能是在EcoR I位点发生了突变，于是就不能够被EcoR I限制酶所切割。经过在不同宿主之间反复地循环生长之后选择出的噬菌体是缺少全部或大多数EcoR I位点的突变体。 插入型载体是一种最为简单的lambda克隆载体。在构建插入型载体时，野生型lambda基因组25的非必需区段被删除。载体本身可以完成生长周期。置换载体上含有一个可被外源DNA片段置换的序列，该序列的两侧有限制性内切酶的识别位点。这段被称为填充片段(stuffer fragment)的序列可以被外源DNA片段所取代。Spi表型进行重组体筛选：是对插入外源基因的置换型载体进行筛选的方式。野生型lambda噬菌体不能有效地侵染P2溶源菌，因此野生型噬菌体对P2干涉敏感（Sensitive to P2 interference, Spi）。 决定Spi表型的基因(red, gam)位于置换型载体的填充片段上。填充片段被外源DNA替代后，重组噬菌体可以侵染携带P2前噬菌体的细胞。当应用这样的细胞作为作为置换型载体的宿主时，只有重组体才能形成噬菌斑。M13是纤维状噬菌体，仅有6 407个核苷酸。基因组为环状单链DNA。紧密排列着10个基因，每一个基因对噬菌体的复制都是必须的。M13 DNA分子是通过大肠杆菌的纤毛进入细菌细胞的。在宿主细胞内，单链DNA分子作为模板生成一条互补链，形成正常的双链DNA分子（replication form, RF）。这个双链DNA分子不会插入细菌基因组，但会持续复制直到细菌中的拷贝数超过100。当细菌分裂时，每个子细胞都能得到一个或多个噬菌体基因组的拷贝，这些拷贝也能继续复制，以保证每个细胞具有恒定的拷贝数。RF DNA再以滚环方式进行复制，形成完整的单链子代DNA，接着新合成的子代DNA被切下来，并进一步环化形成单位长度的M13基因组DNA。游离的M13基因组DNA被不断包装成为M13噬菌体颗粒，并释放出来。每个被侵染细胞在经过一代复制后，都能够产生1 000个新的噬菌体。M13作为克隆载体的吸引力它的基因组小于10 Kb，M13基因组的复制型非常像质粒，因此也能像质粒一样被处理。而且，M13基因组容易从大肠杆菌培养中获得，也能够通过转染而重新引入。以M13为载体克隆基因，能够得到单链形式的DNA。把M13基因组的一部分和质粒DNA结合在一起，构成一种新型的载体，叫做噬菌体质粒（phagemids）。 它是通过把M13基因组中一个1 300 bp的片段导入pUC8中而构建的。M13在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链DNA变成单链DNA，而被导入的那一段M13 DNA则含有这种酶识别的信号序列。尽管这段序列已经从M13噬菌体基因组中被分离出来，但它的功能还在。所以，pEMBL8也可以转化为单链DNA。 pBluescript噬菌粒载体基本结构： 1. 在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动； 2. 同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA； 3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号； 4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。粘端质粒(cosmids,柯斯质粒)是噬菌体DNA和大肠杆菌质粒两者的杂交体。原理：把噬菌体DNA包装进头部的酶仅仅识别cos位点。在体外包装系统中，任何长度在37 Kb和52 Kb之间的DNA分子，只要两端含有cos位点，就能够包装进噬菌体的头部。构建cosmids是为了克服把大片段DNA导入到大肠杆菌细胞中的技术难题。 SuperCosI cosmid vectorA sequence marked ori for DNA replication in bacteria Ampr for ampicillin selection in bacteria A sequence marked MCS (multiple cloning site) that is a polylinker containing unique restriction sites and two phage RNA polymerase promoters (T7 and T3) in opposing directions. Two cos sequences, separated by an Xba1 site An origin of DNA replication from SV40 (permits replication and copy number amplification in many eukaryotic cells, in the presence of SV40 T antigen protein) Neor for selection in eukaryotic cells with the neomycin antibiotic analog G418. Bacterial artificial chromosome (BAC) vectors 利用F因子构建的，含有F质粒的复制起点（oriS），控制质粒复制的基因（repE）,质粒拷贝数的基因（parA, parB），以及细菌的氯霉素乙酰转移酶基因。可以克隆50300 Kb的外源DNA片段。低拷贝数目复制子，避免了高拷贝数目载体中插入片段不稳定这一问题。酵母载体的筛选方式：大多数常用的酵母载体，经常使用一个普通酵母基因作为选择标记，比如一个与氨基酸的生物合成有关的酶的基因。LEU2就是一个这样的基因，它编码的-异丙基苹果酸脱氢酶，在催化从丙酮酸到亮氨酸转化过程中起作用。在用LEU2作筛选标记时，宿主细胞必须是一个营养缺陷型（auxotrophic），含有一个无功能的LEU2基因。LEU2 -的酵母，不能自己合成亮氨酸，必须在加入亮氨酸的培养基上才能存活。这样筛选就得以顺利进行了，因为转化体从质粒上获得了一个有功能的LEU2基因，它们的生长不再依赖于亮氨酸的供应。在实际操作中，我们把酵母细胞培养在不添加任何氨基酸的基本成分培养基(minimal medium)上。只有那些成功转化了的细胞才能够存活形成菌落。yeast artificial chromosome,YAC（1）着丝粒，在细胞分裂时，需要借助它把染色体正确地分配到子代细胞中去。 （2）两个端粒，在染色体的末端的结构，是复制所必需的结束位置，还可以避免染色体被外源外切核酸酶消化。 （3）复制起点，与质粒的复制起点功能一样，是染色体上DNA复制的起始位置。以pYAC3为结构特点：pYAC3以pBR322为基础，插入了一些酵母基因。其中两个基因，URA3和TRP1分别作为YIp和YRp7的筛选标记被介绍过。在YRp7中的那一段酵母染色体DNA除了包含TRP1外还含有复制起点。而在pYAC3中，这段序列扩展得更长，还包含了称为CEN4的一段DNA，即酵母第四号染色体的着丝粒序列。因此，这个插入的片段TRP1-复制起点-CEN4，包含了染色体3个必需成分中的两个。第三个必需组分是端粒，由称为TEL的两段序列提供。现在还剩下pYAC3的另外一个部分没有介绍，也就是SUP4（赭石突变抑制基因），该基因是筛选标记，也是克隆实验中新的DNA插入位点。用原生质体转化的方法把人工染色体转入酿酒酵母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型，trp1-ura-，可以被人工染色体的筛选标记基因恢复成trp1+ura+。在基本培养基平板上培养，可以筛选出转化体。只有那些含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存，如果染色体构建错误，如在被克隆的DNA片段两侧连接了相同的两段载体DNA片段，则因缺少一种筛选标记，使得转化体不能在基本培养基上存活。而外源DNA是否插入，可由SUP4（赭石突变抑制基因）的插入失活判断，即可以简单地由菌落的颜色看出：白色菌落是重组体，而红