最新 综述 生物膜的形成、抑制及其演变的研究.doc

生物膜的形成、抑制及其演变的研究摘要：生物膜(biofilm)是一种附着于组织表面、由其自身产生的细胞外多聚基质(extraceHular maxu-ix，ECM)包裹的有结构的菌细胞群体，由ECM以及被其粘连的菌细胞构成。近年来,生物膜日益受到研究人员的关注，本文主要阐述了一种具有优良特性的真菌酿酒酵母生物膜的形成，表皮葡萄球菌Esp对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制以及生物膜在微生物生存演变中的重要作用。关键词：生物膜 酿酒酵母 金黄色葡萄球菌 抗生素The study of formation,inhibit and evolution about a biofilmAbstract:Biofilms are formed by the aggregation of microorganisms into multicel- lular structures that adhere to surfaces.In recent years, Biofilms has been focused ,this paper had the conclusion of the formation of well-characterized Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus epidermidis Esp inhibits staphylococcus aureus biofilm formation and nasal colonization,and the evolution of species interactions in a biofilmcommunity.Keywords: Biofilm; Saccharomyces cerevisiae; Staphylococcus aureus; Antibiotics一酿酒酵母生物膜的形成生物膜的形成是由众多微生物聚集粘附在物体表面形成的多细胞群体结构。致病真菌可形成与细菌生物膜相类似的生物膜，而且生物膜的形成对真菌的环境适应能力、药物敏感性等生物学特性有较大影响。如念珠菌形成的生物膜有对抗宿主防御机制的作用，并使得念珠菌对临床常规抗真菌药物明显耐药。ToddB.Reynolds和GeraldR.Fink1研究了具有优良特性的酿酒酵母是否会形成生物膜，并研究了其生物膜形成的必要条件。各种真菌的生物膜形成过程不尽相同，但大致可分为几个步骤：菌体与支撑物表面的黏附；形成微菌落，微菌落融合并形成生物膜的基底层；基质的产生和释放；同时伴随菌丝或者假菌丝的形成；结构逐渐复杂，发育为成熟的生物膜。ToddB.Reynolds和GeraldR.Fink通过研究，发现酿酒酵母可以初步形成生物膜。当酵母在较低的葡萄糖浓度下生长时，其紧密地粘附在大量的塑胶表面。而在半固体培养基（含有0.3%的琼脂）中，酵母成簇地粘附在其表面，即复杂的多细胞结构共构成了酵母细胞生物膜，并且经反复清洗后生物膜细胞仍紧密地黏附在表面。把酿酒酵母接种到含有0.3%的琼脂表面的平板，会形成平坦的簇状膜，覆盖的表面积比把酿酒酵母接种到含有2%的琼脂表面的平板形成覆盖的面积大,并且细胞数也比2%的琼脂表面的平板上的多，见图1。 图1：G为野生型酵母菌株在0.3%琼脂板上形成的簇状结构；H为野生型酵母菌株在2%琼脂板上形成的簇状结构；另外还发现酿酒酵母形成簇状结构的能力依赖于细胞表面蛋白FLO11。FLO11缺陷型的菌株在0.3%的琼脂平板上形成的簇状直径较小，缺失形态特征，由光学显微镜和扫描电镜观察得到生物膜的显微结构，如图2。经过12天后，0.3%琼脂板上含有细胞表面蛋白FLO11的簇状结构中的细胞数是缺失FLO11簇状结构的1.6倍。紧密粘附在塑胶表面和成簇粘附形成的生物膜均需要细胞表面蛋白Flo11p。Flo11p是粘附在表面的真菌细胞表面糖蛋白。 图2：k为野生型酵母菌株在0.3%琼脂板上形成的簇状结构；L为FLO11缺陷型的菌株在0.3%的琼脂平板上形成的簇状结构；此外，由同基因MATa,MAT，MATa/的单倍体菌株形成的簇状结构有显著，由同基因MATa,MAT，MATa/的单倍体菌株形成的簇状结构有显著差异。MATa形成的直径较小，但形成的辐射线比MAT多，另外与MAT相比，MATa菌株形成的结构比较粗糙，具有较多的网络线和粗糙的边缘，还有较少的裂片。ToddB.Reynolds和GeraldR.Fink通过研究的数据表明培养基的黏度，酵母细胞表面蛋白FLO11p，培养基中的营养素都会影响到簇状结构的形状。在平板表面的粘附只是生物膜的初步形成。比如，铜绿假单胞菌生物膜的形成组成的微生态菌落被细胞外的多聚基质包裹。这里所说的酵母细胞生物膜的形成是否只是进一步成型的前序还不是很清楚。在查阅参考资料时，ToddB.Reynolds和GeraldR.Fink得知酿酒酵母生物膜的形成需要进一步的成型。 图3：I和C为基因MATa单倍体菌株在0.3%琼脂板上形成的簇状结构；G和A为基因MAT单倍体菌株在0.3%的琼脂平板上形成的簇状结构；酿酒酵母生物膜的初步形成的发现表明，这也许是一个用于发病时这些细胞的表面蛋白作用的基因具体分析的有用的模型。另外，酿酒酵母也可作为有价值的工具用来筛选可以造成真菌粘附的成分，并找到用于抗真菌治疗的可能的方法。二表皮葡萄球菌Esp对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原菌，它能引发很多症状，从亚临床炎症反应到导致肺炎、心内膜炎和败血症的重度感染。它最初富集位置在鼻腔，这是影响葡萄球菌感染的重要因素。然而，研究发现有些人可以避开金黄色葡萄球菌的定殖。Tadayuki Iwase等2对此规避机制进行了研究。他们首先考虑到金黄色葡萄球菌定殖中表皮葡萄球菌可能存在的抑制作用，这是因为表皮葡萄球菌是人类鼻腔中的占优势的共生菌。经过对志愿者鼻腔中细菌进行分离研究后发现，金黄色葡萄球菌携带者和非携带者的鼻腔中表皮葡萄球菌的比例差异不大，见表1，但是，从携带者鼻腔中分离的表皮葡萄球菌的一些特性与从非携带者中分离的有差异。用表皮葡萄球菌细胞或培养上清液和金黄色葡萄球菌共同培养时发现，有接近一半的金黄色葡萄球菌的生物膜形成受到抑制，这说明，表皮葡萄球菌分为两类：一类抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成；另一类不能抑制生物膜形成。表1：金黄色葡萄球菌携带者和非携带者的鼻腔中表皮葡萄球菌的比例差异此外，与非抑制型的相比，抑制型表皮葡萄球菌的培养上清液能破坏金黄色葡萄球菌既存的生物膜，见图4。单因素Logistic回归分析显示在表皮葡萄球菌存在的情况下，金黄色葡萄球菌的检出率要远远低于没有表皮葡萄球菌的情况。抑制型表皮葡萄球菌的存在可作为抑制金黄色葡萄球菌定殖的潜在决定性因素。图4：表皮葡萄球菌对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用为了鉴定抑制型表皮葡萄球菌中的抑制因子，Tadayuki Iwase等收集了其培养上清液，经过一系列分离纯化后得到只有单一组分的分离蛋白。经过氨基酸序列分析后确定为表皮葡萄球菌丝氨酸蛋白酶（Esp）。对非抑制型表皮葡萄球菌的上清液进行同样的分离纯化处理未得到这种蛋白酶。为了进一步验证Esp对金黄色葡萄球菌生物膜的破坏作用，Tadayuki Iwase等筛选出等基因Esp缺失突变株，它的上清液未显示任何生物膜破坏活性。然而，在补充Esp基因后，抑制活性恢复。此外，在使用丝氨酸蛋白酶抑制剂APMSF之后，Esp对生物膜的破坏作用受到阻碍。纯化的Esp对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制有剂量依赖性。Esp能破坏几乎所有的有各种金黄色葡萄球菌形成的生物膜。而且，在实验期间，金黄色葡萄球菌对Esp的敏感性没有变化，即没有抗性。通过显微技术分析发现，Esp能改变金黄色葡萄球菌的固着形式和游离形式。经过Esp处理后，金黄色葡萄球菌生物膜中的细胞间基质消失。Tadayuki Iwase等还对Esp的特性进行了研究，包括其对宿主免疫系统的影响。研究发现Esp单独存在时对生物膜中的金黄色葡萄球菌不具有杀灭作用，而-防御素-2（一种人体天然免疫系统的抗菌肽成分）有低杀菌作用。两者结合能有效杀死生物膜中的金黄色葡萄球菌。这表明抑制型表皮葡萄球菌分泌的Esp对金黄色葡萄球菌的抑制效应是源于一种新的机制，而不是已知的细菌间相互作用机制，如生长抑制、杀菌作用或者对特定粘附分子的竞争。为了研究细菌间相互作用对金黄色葡萄球菌在鼻腔中定殖的直接影响，将表皮葡萄球菌细胞引入金黄色葡萄球菌携带者的鼻腔中，结果显示野生型表皮葡萄球菌能消除金黄色葡萄球菌的定殖，而等基因Esp突变菌株不能消除定殖。而且，纯化的Esp能清除金黄色葡萄球菌，而非抑制型表皮葡萄球菌不具有这种清除效应。三抗生素的对微生物形成生物膜的作用微生物可以产生相互协调互利的信号，它们还可以产生可以杀死捕食者，压制竞争者或制止捕食者的抗生素。William Croft Ratcliff 和 Robert Ford Denison3最近的研究表明，抗生素常常充当互惠互利的信号。暴露于尚不会致死的浓度的抗生素确实会改变微生物的代谢作用，甚至会以有利的方式改变微生物的行为，引发逃离或隐藏等反应。但是，对于这些混合物功能的威胁信号的分裂确是错误的也许有其它的产生抗生素的相关信息或行为：线索和操作。 这种把抗生素认定为有益信号的假说提出，在自然中，抗生素进化作为不相关的微生物种群中交流的方式，但是在实验室中却会导致它们死亡，因为抗生素的浓度和细胞的非自然的高密度。然而，进化理论预示着不同种群之间善意的信号将会很罕见。种族之间信号传递的进化稳定需要共同的利益，例如交流的结果使得发送者和接收者都受益。这样的利益共享对在有限的资源中竞争的种族来说是罕见的。即使面临迫切的条件需要演变，那么在种族之间的信号互利也比在种族之内要不常见的多。然而，有益的信号也不是唯一可行的替代抗生素（致死）成分的功能。微生物在检测到低浓度的抗生素可能会把这个成分当成一种引物，暗示将来这种化合物的浓度会增加。紧接着，本能使它们做出反应以降低它们的敏感性。例如，铜绿假单胞杆菌对四环素的反应是生成生物膜，从而减少暴露于抗生素中的面积，就像一只动物加入到一群中会减少被捕食的机会。因为生成生物膜就会减少抗生素的作用，这一行为有利于暴露的微生物，对产生者来说就没有益处，这时的抗生素就作为一个信号。与假说相符合的是，抗生素可以作为一个引物，由产生者进行代谢产生副产物诱导发生有利于暴露于环境中的接收者的变化，例如细胞壁碎片和DNA，显然就算不释放给传输者信息照样也可以导致行为的变化。抗生素的成分也可以看做是操作因素。例如，一些微生物通过种族内的信号模仿来协调集团层面的行为，例如毒性、菌丝生长量或者生物膜的形成。这可以骗过暴露的微生物使它们选择不利于适应的物理状态或行为。例如，接触到妥布霉素会引起假单胞杆菌引动速度加快和逃离。因此，通过微生物竞争资源产生的抗生素就减少了。一些操纵的行为又相当复杂：粘菌属的阿米巴变形虫当处于饥饿状态或产生孢子就会数以万计的聚集起来。此外，操作并不是限制于微生物与微生物的相互作用中，也是交叉于生物领域。固氮细菌产生根瘤菌毒素，一种可以抑制产生此毒素的豆类合成激素乙烯，植物的生长速度也会减慢，但是此细菌的资源采集会增加。微生物化合物是否作为一种威胁、信号、引物或者操纵物完全依赖于互相作用的结果，见图5。信号使发送者和接收者双赢，引物使接收者受益，操纵物使发送者受益却使接收者受到伤害。威胁物，类似于操纵物，以接受者为代价对产生者有益，但是通过致死或伤害代替诱导不适应行为完成交流。为了确定自然界中这些成分的功能，这些结果在微生物演变的环境中必须被测量。图5：抗生素对微生物的作用以及微生物作出反应的几种模式如果许多不同种的微生物都是利它的并且因为相互的利益频繁相互交流，那么就可以把抗生素看做是“调节微生物群落动态平衡”。但是，这个论点没有进化的益处：种群间的遗传变异相对于群落内很小，部分是因为去诺间的个体转移。因此，个体和同类的选择、陷入群落层面的选择和个体都不会因为全部群落的利益而演变。同样，假定人的肠道释放的信号对微生物和人都有益处可能实际是操纵或没有引起注意的引物，这完全取决于它们是否减少或增加宿主的免疫反应。 在研究抗生素所扮演的角色过程中，我们不应该忽视多种功能的可能性。归类为抗生素的分子也许确实被当做信号来调节相关微生物的行为。研究表明这种交流的特殊之处将会提高我们对微生物演变与生态学的理解，并且将会的出对微生物感染的新的治疗思路。例如，细菌的生物膜是人类微生物感染持续的主要因素。这些也许可以通过干扰需要的信号形成生物膜或者故意提供信号协调分散，这两条都认为是操作的途径。四生物膜群体中各种群之间的演变SusseKirkelundHansen,PaulB.Rainey,JanusA.J.Haagensen,SrenMolin4研究了生物膜群体中各种群之间的演变，并从从以下两个方面进行了阐述。1.生物薄膜协助内生菌抗逆植物内生菌形成生物薄膜的现象在植物组织中极为普遍，表明了生物薄膜对于植物内生菌可能有着重要的生态学意义，而目前对于生物薄膜的研究也支持了这一点。事实上，生物薄膜对于微生物的独特的生态学意义问题，也是引起人们的注意的一个很重要的原因。体外研究发现，当许多病原细菌在形成这种多细胞聚集体的结构后会展现出显著的抗药性。测试铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生物薄膜和游离的单细胞对铜、锌、铅这些重金属的相对抵抗水平，会发现生物薄膜抵抗重金属的压力要比游离的细胞高出2-600倍。Scher研究了沙门氏菌(Salmonella sp)的生物薄膜中的细菌与游离细菌耐受次氯酸钠、酸、热等逆境能力的差异，发现生物薄膜中的细胞对于次氯酸钠等不良环境因素的冲击有明显高于游离细胞的抗性。除此之外，形成生物薄膜后的细菌在抗紫4、抗干燥等方面都已在一些细菌中得到了验证。2. 内生菌形成生物薄膜结构对于宿主植物的生态学意义作者通过恒化器实验得知，形成生物薄膜等的多细胞聚集结构是植物内生菌与宿主相互作用的一种重要形式。植物体为内生菌提供一个绝佳的营养和水分丰富的黏附表面。而形成这种结构对于植物本身也有着重要的生物学作用。五总结 通过对酿酒酵母生物膜的形成以及各因素对生物膜的形成的影响，可知，这可能是一个用于发病时这些细胞的表面蛋白作用的基因具体分析的有用的模型。另外，酿酒酵母也可作为有价值的工具用来筛选可以造成真菌粘附的成分，并找到用于抗真菌治疗的可能的方法。另外，Esp通过一种新的细菌间相互作用机制阻止了金黄色葡萄球菌在体内的定殖，而且这一机制能促进预防金黄色葡萄球菌定殖和感染的新型治疗学的发展。在抗