目的蛋白表达与纯化protocol.doc

目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试：1、 挑一单克隆到3ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h12h。2、 保种：700l菌液+400l 80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。3、 扩大培养：以1:100接菌，即取50l菌液到5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h3h至OD值达到0.6。4、 对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。对照5、 另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000 IPTG（终浓度为1mM），370C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。370C样品6、 其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养1224h（通常18h）后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。160C样品7、 Bugbuster分别处理上述三个样品，取20l总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：对照 370C样品 160C样品 总蛋白 上清 沉淀 总蛋白 上清 沉淀 总蛋白 上清 沉淀若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。大量表达：1、 挑一单克隆到7.5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h12h。注意：此步用50ml离心管摇菌！2、 扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h5h至OD值达到1.0。3、 对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。（对照）4、 其余约菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养1224h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C保存。5、 Bugbuster分别处理上述两个样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定。（同小量表达中的7）菌体破碎（高压破菌法）：1、 若目的蛋白在上清中有表达，则可取剩余菌体N g (根据目的蛋白的表达量而定)，用4-6N ml的lysis buffer将菌体重悬，加入0.1mM的PMSF，置于50/100ml小烧杯中，并将烧杯置于冰上。2、 用超声破碎仪进行破碎，功率一般为100W200W，超声时间为3s，间隙时间为5s，工作次数一般为994次。3、 将破碎后的菌液移入50ml BECKMAN高速离心管中，18000rpm、40C离心30-40min，将上清移入一个新的50ml离心管中。Ni柱亲和层析：Lysis buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, pH 8.0（可加入5-10%的甘油和1mMdTT，20mM咪唑）Wash buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, 20mM 咪唑, pH 8.0Elution buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM 咪唑, pH 8.01、 取适量的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddH2O冲洗beads，一般为10CV5（CV代表柱体积，下同）。2、 用lysis buffer进行平衡：10CV5。3、 将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中，Mix 12h。4、 500g，40C离心2min，收集上清flow-through。5、 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清wash 1。6、 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清wash 2。7、 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清wash 3。8、 将beads灌入玻璃柱中，继续用wash buffer洗10CV3。9、 用Elution buffer洗脱：0.5CV10，用EP管分别收集eluates。10、 SDS-PAGE电泳鉴定。Resin regeneration:1、 用0.1M EDTA洗2CV（清洗至beads为无色）。2、 ddH2O洗5CV。3、 0.1M NaOH洗2CV。4、 ddH2O洗5CV。5、 加2CV的NiCl2。6、 ddH2O洗5CV。7、 用20%乙醇洗2次beads，置于480C保存。GST柱亲和层析：Lysis buffer: 1PBS (140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3)Wash buffer: 1PBS Elution buffer: 50mM Tris, 10mM reduced glutathione, pH 8.01、 取1ml的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddH2O冲洗beads。2、 用lysis buffer进行平衡：10CV5。3、 将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中，Mix 12h。4、 500g，40C离心2min，收集上清flow-through。5、 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清wash 1。6、 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清wash 2。7、 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清wash 3。8、 将beads灌入玻璃柱中，继续用wash buffer洗10CV3。9、 用Elution buffer洗脱：0.5CV10，用EP管分别收集eluates。10、 SDS-PAGE电泳鉴定。Resin regeneration:1、 用6M guanidine hydrochloride洗2个柱体积。2、 立即用1PBS洗5个柱体积。3、 用70%乙醇洗34个柱体积。4、 立即用1PBS洗5个柱体积。5、 用20%乙醇洗2次beads，置于480C保存。StrepTactin柱亲和层析：Wash buffer: 100mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0Elution buffer:100mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 2.5mM desthiobiotin, pH 8.01、 取适量的beads灌入玻璃柱中。2、 用wash buffer进行平衡：10CV5。3、 将破碎后的上清灌入装有beads的玻璃柱中，控制流速为1滴/2s，收集flow-through，再重复上样一次。4、 用wash buffer冲洗：1CV5，收集washes。5、 用Elution buffer洗脱：0.5CV6，用EP管分别收集eluates。6、 SDS-PAGE电泳鉴定。Resin regeneration:Regeneration buffer: 100mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM HABA, pH 8.01、 用regeneration buffer冲洗柱子，5CV3，直到柱子变为红色且颜色均一。2、 加2CV wash buffer或regeneration buffer，置于480C保存柱子。凝胶过滤层析（Superdex 75/200）：Binding buffer: 20mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.01、 ddH2O冲洗2CV: flow rate: 1ml/min, Alarm_pressure: 0.3MPa（下同）。2、 binding buffer平衡2CV。3、 样品离心：12000rpm, 40C离心30min。4、 冲洗loop: ddH2O洗5个体积，binding buff