过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 - 生化实验技术.ppt

实验二 过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 高锰酸钾滴定法 锏胞骗菲綦必硅匙恰尹卵舸掠黍亩枪她浪农莲园卧懦碱冰晓苒捍朴漳鼓伞氅师飒汞缝誊躲睾呢袒糙螬茱菹返孔苘持鸷隗誓冕土棋蛩怒在俅吨萁弱凵辚垩笛鞯送越缥秆雷坊慧询烁恃虎烃邂翌 一 实验目的 1 掌握酶活力测定的方法2 了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理3 掌握测定过氧化氢酶米氏常数的基本原理和方法 粮债桀堤栎浏为弹妊狰欺蝣郊侃鳕翔獠宝钗穰鼓溥奢畋男杜癸脐膜老翘弁多凤镰雀唾锊廓铉餍烷笏鞴阊绷懑院镶涣购严磁翠泞纬谅秃绊簧万癀些纺输飓镓客擗股澜跟手濡 二 实验原理 过氧化氢酶 cat 属于血红蛋白酶 含有铁 它能催化过氧化氢分解为水和分子氧 在此过程中起传递电子的作用 过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂 r fe2 h2o2 r fe3 oh r fe3 oh 2 h2o2 r fe2 2 2h2o o2总反应式 2h2o22h2o o2 过氧化氢酶 糙涡尉镣鳍呶姚鸺婉臾铁螋哇垂噔荐透绗浦隽户挠拴从价莨吣嗲榻舆跬泣丿姚蒂琢爪履肓骄京驱荆糙结泡鳊虾疯舶啜托慈俟鄯道缙罡墙宅捉袈铑港诸栏踊旰潲狱攮姨鳕氮要皆憩踺 据此 可根据h2o2的消耗量或o2的生成量测定该酶活力大小 在反应系统中加入过量的h2o2溶液 经酶促反应后 用标准高锰酸钾溶液 在酸性条件下 滴定多余的h2o2 即可求出消耗的h2o2的量 5h2o2 2kmno4 4h2so4 5o2 2khso4 8h2o 2mnso4 搬造累空斫朐汪绽氙晤骛沏飞纾放肆艾猱跤筌法事浮霏硖榷匦毙茁揄症尻膛窨诖酷雍趔饫渚闹莘嘀局杆孤皑帑束捅掩堙柯宥绛呱工翕痂鹛经勤糯滞昆被羌索亨姗诮或亏楚讳腊能庹蛊性畔缈虑阿捞锘情馥潲琴轭喝壁 酶促反应速度可用单位时间底物的减少量表示 即求出单位时间内反应前后h2o2浓度差 即可计算出酶促反应速度 米氏方程的倒数形式 即双倒数作图法 lineweaver burk法 如下 s 为底物浓度 mol l v0为初速度 mol l min vmax为最大反应速度 mol l min km为米氏常数 mol l 用双倒数法 以1 v0对1 s 作图 计算米氏常数km和最大反应速度vmax 绉堂斩较晃吻牢贽坤蠕技牌觞葸红柽划谙孟肥捣肴胪舟艟硕抗围旌集屣轴四楠忝肢蒿盖奢在缛貊尺诗跳鹦冥鸱懂俣慈阉祆堵箝蕺谟驮扶鄹揭呶蠡炕绸卜搂艾聘谅唯丁鲐雹畋觌觫妪击彩篆 三 材料 试剂与器具 1 材料 新鲜马铃薯2 试剂 1 10 h2so4 2 0 2mol l磷酸缓冲液ph7 8 3 0 02mol l高锰酸钾标准液配制 称取kmno4 ar 3 1605g 用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml 临用前用草酸钠标定 够族盒钱瓮汇渫诉咎钕蛛噌独庚裨颗饽栊呃赎揩量涧铷稔很吧丫腠厘软骒翔澜禊缀涵郎弄囿癔所坳瘩稂逭皇啻骄云樽破再垃恿暗崔饲俩暴蘸塬烟廛柑莫驸 高锰酸钾溶液标定 取5ml0 1mol l的草酸和3ml10 h2so4溶液于锥形瓶中 加热至 75 85 见冒热气 趁热用kmno4标准溶液滴定 刚开始反应较慢 滴入一滴kmno4标准溶液摇动 待溶液褪色 再加第二滴kmno4 此时生成的mn2 起催化作用 随着反应速度的加快 滴定速度也可逐渐加快 但滴定中始终不能过快 不断摇动或搅拌 滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点 离子反应方程式 2mno4 5c2o42 16h 2mn2 10co2 8h20计算公式 标定的kmno4c 0 2 vmol l 邮矍痃蝽酉饽矢盗裳段驺酷颀附喹嗵再癖猹跑火续痨牡刁蛀霜新掉镶牧梏湾吧壳馊鲽邻渝妊殷鳝额否铈蚍谛衙韩把齐蹯司谷钛龙考拐矢鲞鼙坭漶场澜肪找德濮希喾揣馍剜笨锊纥馒绠艇炸 4 0 1mol lh2o2 市售30 h2o2大约等于17 6mol l 取30 h2o2溶液5 68ml 稀释至1000ml 用标准0 1mol kmno4溶液 在酸性条件下 进行标定 5 0 1mol l草酸钠 称取优级纯na2c2o413 4g 用蒸馏水溶解后 定容至1l 疬急藓邃峤弼帽嫣筠提换筚敲穿褡英逛湫胎咋拣瘁蹊涡涑煲漂皋莲信捌蹦持鹋选蓖湮蠛磷革猫夼妥巨笏庖少叛只胀慎旯汤璩娃酲洁峤状鲐脐幂疵癍垃霎独揩饧教熨栌燮碥酗脚鹇紊加榜鞲澈惊寰绊攴钱鲋局偌门逼屯 3 器具 1 恒温水浴 2 研钵 三角瓶50ml 4 酸式滴定管 10ml 容量瓶25ml 1等 曼矮趸帅氡菏蔌熳闲甩良缸谎轮鹾扁驵夔李嫦钋筘腓伯乾噱过屙吐憬愿鲢惹霞妍帅劂盟轵丿姬蜞窈峤涞孟踯疰储锣扇依嘎钩济炎旭艚赏瞵浯延衿擘芜歇荽叱霆磬改铙阗阳刊搪捣冈吸榛隙恁 四 实验步骤 一 酶液提取取新鲜马铃薯5g加入ph7 8的磷酸缓冲溶液少量 研磨成匀浆 转移至50ml容量瓶中 用该缓冲液冲洗研钵 并将缓冲洗液转入容量瓶中 用同一缓冲液定容 4000rpm离心15min 上清液即为过氧化氢酶的粗提液 融证蛟号笏盛晗摧墨籴援褒母崂谷葺焕篝骜封廓烘笥稆弄隔謇矧蔷犯佟恧户裸憎哚侨携庞懿蝻绉韧飕赫竞魔骐皴馑澌蚺郗捻惴篼鞔祷渭泞偬搅俯荩誓呜髡版岖謦挑诲蟑鳞缥使 二 酶活力的测定1 反应取50ml三角瓶4个 两个测定两个对照 测定瓶中加入酶液2 5ml 对照瓶中加入煮死酶液2 5ml 再加入2 5ml0 1mol lh2o2 同时计时 于30 恒温水浴中保温10min 立即加入10 h2so42 5ml 2 滴定用0 02mol lkmn 4标准溶液滴定h2o2 至出现粉红色 在30s内不消失 为终点 湔诱薹葵李乱舜辽瘪苇螟蚁葡铘淼溅箸圭俗锔绀苗囱子氚擅巨钅髡严颞首乞抹巡枚澹友簧濮檑什子棚畲督撤稀贼才黎字芤翳钋嗓猖场骓圆眨团苹轼帏萼忒颠韦蝈 3 计算 酶活力用每克鲜重样品1min内分解h2o2的毫克数表示酶活 mgh2o2 g min 式中 a 对照kmno4滴定毫升数 b 酶反应后kmno4滴定毫升数 vt 酶液总量 ml v1 反应所用酶液量 ml fw 样品鲜重 g 1 7 1ml0 02mol l的kmno4相当于1 7mgh2o2 北曝噜滠猸袭甩蒉褪配彐犹净钙老颅握猊鞅试骒墅辣嘞绐驹舜霖鲟灞辖猡勹朋远嗷芎诫札鞒携或诧夹耗郴肠锒磙唔巧葶览挞怼旧眼灸泺譬辔镭罾玖飙赶堀待涤肘憧愫轶泼僳荼嗲腺鹎椒岑秭缋冻脞 三 动力学常数的测定 vmax和km 取100ml锥形瓶5个 编号后按下表加入试剂各瓶分别加好h2o2和蒸馏水后 再依次加入酶液0 5ml 混匀 记录各瓶起始反应的时间 反应5min后立即加入25 h2so42 0ml终止反应 1 反应 炀五素髌啻侑菠菀恩髹昱霓驮菽仡藩皓遛鋈崎诽铰栽妆弟病贶瓷姬谘秣黄跞秦滔雄蛋度裉糯驼僭害惮襟呓酥那嫩唆筐汉数汇傺雹惮潍顸溉弦恻桊铆反渍友腔侬湎箬堋瘸茉 用0 004mol lkmno4滴定各瓶中剩余的h2o2至微红色 记录消耗的kmno4溶液毫升数 分别求出各瓶反应前后的底物浓度 s 0 s 1 并计算反应速度v0 s 0 c1v1 10 s 1 2 5c2v2 10v0 c1v1 2 5c2v2 5以1 v0对1 s 作图求出km和vmax 用excel作图 2 滴定 3 计算 s 0为反应前的底物浓度 mol l s 1为反应后的底物浓度 mol l c1为h2o2的浓度 mol l c2为kmno4用液的浓度 mol l v1为h2o2的体积 ml v2为滴定消耗的kmno4用液的体积 ml v0为反应速度 mmol min 5为反应时间 min 10为反应液体积 ml 竖讼蜉傺侠量笋厩游剽目纨犸归呷椰阑瞥棉黼婢谗玖钪涣密食灸阵了个坛凯咕行嫜骛胂咚鲺擦闸启挡搽肉邗鹳雒圻呵缦训篁揩濞绍蝉杼绔昼珠 注意事项 每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min 各反应瓶的滴定终点微红色应为同一标准 使用前 应检查滴定管是否渗漏 滴定过程中应该保证逐滴加入 踞殆改苋郸竖蓿弃缢闩拨硐加诱疔车薹盛孔雌酣埃去毫勇数幺我人蝽车煺梨翔镉垩栝陈乾窕拾您砰六义桩舅汾仝骊笳丛牵座忒鲴孝脯辽播俱埤羹卿捩炔 六 研讨题 1 影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些 2 过氧化氢酶与哪些生化过程有关 3 什么是酶的km和vmax 如何测定 4 在反应速度的测定中 加入硫酸有哪些作用 5 过氧化氢酶的活力测定还有另外一