schowsky还原银法标记神经元、脑干轴索的变化研究.doc

附件2昆明医科大学“大学生创新性实验计划”项目申请表项目类别： 学校资助项目 学院资助项目 项目名称：大鼠多重脑震荡后用改良Bielschowsky还原银法标记神经元、脑干轴索的变化研究 项目申请人： 郭剑龙 所在(院)系： 法医学院 专业： 法医学 申请人电话：指导教师： 于建云 单位和职称： 法医学院 （教授） 联 系 电 话：填 表 日 期： 2012年11月19日 昆明医科大学教务处制一、项目团队情况项目申请人姓名郭剑龙性别男民族汉族出生日期1991.11所在院系法医学院专业法医学年级2011级电目组其他成员（不包括申请人和指导教师）姓名性别年级所在院系专业分工签名郭冠麟男2011级法医学院法医学试剂配制及染色高海兆男2011级法医学院法医学Bielschowsky银染何光凯男2011级法医学院法医学Bielschowsky银染黄曾杰男2011级法医学院法医学MCC模型复制指导教师姓名于建云性别男民族汉出生日期19627学历博士专业法医病理学所在院系法医学院职务高等教育研究所所长、脑损伤研究室主任职称教授研究方向脑损伤电前从事的教学、研究工作简介于建云，男，1962年7月生，外科学博士，法医学二级教授，硕士研究生导师。昆明医科大学法医病理学科带头人，校级骨干教师。现任高等教育研究所所长、脑损伤研究室主任，国家自然科学基金项目函评专家（年至今），中华病理学会云南省分会委员，中华神经外科学会云南省分会委员，中华行为医学与脑科学杂志编委，昆明医科大学学报编委，美国神经科学与脑外伤学会会员，云南省解剖学会常务理事，云南省高等医学教育学会常务理事兼常务副秘书长，中国高等法医学教育学会理事。从事教学、科研及教育管理28年，先后副主编、参编全国法医病理学、法医学规划教材11部，发表学术论文104篇。获云南省教学成果一等奖3项，全国高等医学教育研究优秀研究成果一、二等奖各一项。先后主持完成国家自然科学基金及云南省自然科学基金项目共6项。二、项目简介用于建云脑损伤研究室的单摆闭合性脑损伤打击装置与大鼠脑震荡（CC）判类回归方程，建立多重脑震荡（MCC）大鼠模型，采用改良 Bielschowsky还原银法显示鼠脑皮层神经元及脑干轴索，并采用Image-Pro Plus 6.0高清晰图文分析系统，根据不同观察研究对象性质，分别用神经元及其突触、神经细胞、轴突的数密度（NA）测量；轴突平均直径（D）、轴突横穿点密度（QA）测量；脑水肿细胞间隙平均面积（A）、细胞平均中心距离（Z）测量等，进行分析，将得出的结果与先前研究的单重脑震荡后轴索银染结果相比较，从而得出单重和多重脑震荡后大鼠皮层神经元及轴索改变特点，并延长试验时间，探讨MCC大鼠皮层神经元及轴索在伤后64天的改变情况，以进一步了解三重脑震荡鼠神经生物学基础。三、研究目标（简要陈述所申请研究项目最后要达到的目标）（1）预期得出改良Bielschowsky还原银法在多重脑震荡后显示鼠脑皮层神经元及脑干轴索的优缺点。（2）得出多重脑震荡后64天大鼠皮层神经元及脑干轴索银染改变的特点，并与先前研究的单重脑震荡相比较，得出单重脑震荡和多重脑震荡后大鼠皮层神经元及脑干轴索银染改变的特点。（3）预期培养5名本科生脑震荡研究方面的知识，石蜡切片及银染方面的知识、Image-Pro Plus 6.0高清晰图文分析系统在统计结果中的应用以及统计学研究方法方面的知识。（4）发表论文1篇。四、立论依据（包括项目研究意义、国内外研究现状分析、请附主要参考文献及出处）（1）研究意义随着竞技运动的广泛开展与普及，它在给运动参与者带来极大快乐的同时，也给他（她）们带来了巨大的运动性损伤与痛苦。因运动造成的脑损伤（Sport-related traumatic brain injury,sTBI）是发生在竞技运动尤其是在拳击、跆拳道、橄榄球、垒球、足球、曲棍球、棒球、篮球等运动员相互紧密接触、竞技性激烈的运动项目中最为常见的一类损伤1,2,3,4。其中，大多数sTBI属于不同程度的脑震荡，又称为运动性脑震荡（Sports-Related Cerebral Concussion,SRCC），Weber.J等5（1999）报道在各种运动损伤中，SRCC的发病率高达80%以上，故SRCC是最多见的运动性损伤类型。通常，一般人的一生只可能发生一次脑震荡（Cerebral Concussion,CC/brain concussion,BC），而在一个喜爱运动的参与者身上，则可能在短时间内发生多次的SRCC。1973年，Richard Schneider发现当一名运动员在经历一次CC尚未恢复时，又遭受第二次SRCC后，会出现更为严重的神经与学习记忆方面的障碍，甚至死亡，1984年美国Saunders和Harbaugh首先将这一现象定义为二次冲击综合征（Second Impact Syndrome，SIS）1,2。经临床与流行病学观察发现，在一些竞技性强、运动员密切接触的运动项目中，运动员极易发生多次性脑震荡（multiply cerebral concussion，MCC）并产生二次冲击综合征（SIS），在遭受过SRCC的运动员，其SIS发生率将上升6-9.3倍，其严重程度与受伤的间隔时间有关9.10。于建云等在先前长期CC大鼠研究基础上，首次在国内建立了三重大鼠脑震荡（3MCC）模型（即每天打击一次、连续打击3次的MCC鼠模型），先前于建云等用 Bielchowsky银染法染色单重脑震荡(PCC/BC)大鼠，光镜显示: 单重脑震荡后鼠脑干轴索结构变化表现为直径增粗,或呈串珠状、 畸形状或收缩球样改变,或染色不均,间质水肿等;透射电镜显示:轴索超微结构在 BC/CC后 3 h髓鞘开始水肿并出现不同程度的分离,纤维周围及胶质细胞水肿,毛细血管扩张淤血或闭塞、 血小板血栓形成等。BC后 12 h开始出现部分轴索的溶解,BC后 432 d髓鞘水肿腔隙明显、 增厚显著,直到伤后 64 d脑干神经轴索仍未恢复正常11,12。于建云等使用Bielchowsky银染法染色研究三重脑震荡后神经元和轴索的变化，得出1-24d皮层、海马和脑干网状结构神经元不同程度固缩变性,以2d组为重；轴索不同程度的肿胀、变形、排列紊乱、收缩球形成；轴索直径平均值均大于对照组, 以2、4d组最为明显13。先前的研究显示三重脑震荡后脑损伤更为严重21，22，24，但是前期的银染研究时间较为短，未观察到24天以后的变化，本实验弥补了此处空白。在研究神经组织的形态方面,尤其是显示各种神经末梢则以银染法较为理想, 最大特点是在镜下可控制其反应程度或效果。神经组织的浸染, 最细的末梢也能清晰显示出, 而结缔组织着色很淡14,15,16,17。银染通过不断改良和改进方法，神经末梢及轴突的染色主要分为 Golgi cox 法和 Bielchowsky银染法两大类14。然而 Golgi cox 法的不稳定性和 Bielchowsky 银染法的耗时过长的缺点使得该技术被新兴技术所取代。有报道说改良Bielschowshy还原银法在显示神经终末较为理想，该法最大特点是在显微镜下可控制其反应程度, 最细的神经终末也能清晰地显示17,18,19。多重脑震荡后大鼠神经元及轴索64天用银染方法染色的变化如何呢，本实验弥补了此处空白。（2）国内外研究现状及发展动态对SIS的认识，至今才20多年的历史1,2。关于多次性脑震荡（MCC）研究的学术用语也非常烦多，有的将其称为重复性脑外伤（Repetitive trauma brain injury，RTBI）、重复性头部损伤（Repeat head injury，RHI）、多次性头损伤（Multiple head injuries,MHI）等等。由于MCC临床病理研究材料难以获得，国外大量研究仅仅停留在临床病例观察，临床心理测试及疗效评价方面。国外学者多从临床与流行病学研究的角度，对遭受SRC及SIS患者的临床表现，易感因素分析，神经认知与电生理检测、神经精神改变与心理情感变化等方面就行了较多的观察分析。结果发现MCC(RTBI)以青年人多见，令人不解的是SRCC虽属轻微脑损伤，但部分MCC(RTBI)患者则会出现更严重和持久的PCS，其中神经行为改变与认知障碍较为突出，且随着CC次数的递增，发生SIS所需的外部力量越来越小；严重者会在第二次CC后发生死亡，个别病例尸解时以急性脑充血、肿胀和难控性高颅内压为主，无颅内占位性病变，常规的CT和MRI影像学检查难有阳性发现1,2，3,4,5,6,7,8,9,10。国内于建云等（2006）在国家基金支持下，在先前长期CC大鼠研究基础上，首次在国内建立了三重大鼠脑震荡（3MCC）模型（即每天打击一次、连续打击3次的MCC鼠模型），并通过空间参考记忆与工作记忆等认知行为、感觉门控，胆碱能神经、多巴胺能神经和5-羟色胺能神经变化的研究，获得了大量极有意义的发现20,21,22,23,24。特别是严格采用了于建云等（2008）研制的实验大鼠轻中型闭合脑损伤分级昏迷指标与判别多元回归方程，严格控制轻型脑损伤（CC）鼠才被选为入组实验动物，有效地保证了实验结果的效度与信度，结果发现MCC鼠存在有认知行为、神经元与轴索变性、部分递质的相关合成限速酶等方面存在某种损伤累计效应，与临床观察结果非常一致，符合MCC为闭合性、轻微脑损伤，缺乏明显的神经病理学改变，很少发生死亡的特点，是目前较理想的SIS机制研究大鼠模型。 综上所述，本研究用金属单摆闭合性脑损伤打击装置复制多重脑震荡大鼠模型，采用改良Bielschowsky还原银法，显示鼠脑皮层神经元及脑干轴索,得出多重脑震荡后64天大鼠皮层神经元及轴索银染改变的特点，及其与单重脑震荡大鼠的区别。主要参考文献 1.Kelly J. Sports-related recurrent brain injuryUnited State. MMWR Morb Mortalwkly RepJ.1997 Mar 14;46(10):224-7。 2.Nicholas M.Wetjen, Mark A.Pichelmann, John L.D Atkinson. Second Impact Syndrome:Concussion and Second Injury Brain ComplicationsJ.Am Coll Surg,2010.211(4):553-557。 3.Ravdin LD, et al. Assessment of congnitive recovery following sports related head trauma in boxersJ. Clin J sport Med.2003 Jan;13(1):21-27。 4.Pieter W, Zemper ED. Incidence of reported cerebral concusion in adult taekwondo athletes.J-R-Soc-HealthJ.1998 Oct;118(5):272-279。 5.Weber J, Jaksche H. Craniocerebral trauma in sport with recommendations for prevention sportverletz-sportschadenJ.1999 Mar;13(1):30-35。 6.Echemendia, Ruben J., Margot D. et al. Neuropsychological Test Performance Prior To and Following Sports-Related Mild Traumatic Brain Injury. Clinical Journal of Sport MedicineJ.2001 1;11(1):23-31。 7.Cobb S, Bttin B. Second-impact syndrome(review).Jsch NursJ. 2004. Oct;20(5) 262-7 8.Ferguson RJ. Postconcussion syndrome following sports-related head injury:expeclationas etiology.Neuro-psychologyJ.1999 Oct;13(4):582-589。 9.Zemper ED. Two year prospective study of related risk of a second cerebral concussion. Am-J-Phys-Med-RehabilJ.2003 Sep;82(9):653-9。 10.Collins MW, et al. Cumulative effects of concussion in high school athletes.NeurosurgeryJ.2002 Nov;51(5):1175-81。 11.吴春云,郭泽云,于建云等.脑震荡对大鼠脑干轴索和髓鞘的影响.昆 明 医 学 院 学 报J.2008,(4):1-5。12.于建云，李树华，高林波.脑震荡大鼠脑干神经纤维组织病理与超微结构损伤后 64天动态改变观察.神经解剖学杂志.2008 24(5):478482. 13.于建云(通讯作者)，李俊祥，李娟娟。三重脑震荡鼠模型建立及组织病理学动态改变观察。中华神经外科疾病研究杂志J，2010，9（4）：337-340。 14.孟云莲. 现代组织学和细胞学技术 M . 武汉 武汉大学出版社 2004. 15.郑翔 马玉琼 章为. 避免 Golgi 银染标本表层产生铬银沉淀的一个方法 J . 解剖学杂志 2008 31(6): 871-872. 16.王飞石 杨飞鹏 陈晓萍.常规石蜡包埋法在改良 Golgi 银染法中的应用.科 技 通 报.Jan. 2011(Vol.27 No.1):57-60. 17.杨少芳.改良Bielschowsky法对神经末梢的显示.解剖科学进展.2005 , 11( 4) : 382 18.曾赛凡,张声.固绿髓鞘染色法和 Bielschowsky 神经轴突染色法在诊断中枢神经脱髓鞘假瘤中的应用.临床与实验病理学杂志.2003 Apr;19(2):216-217. 19.王京景.改进的Bielschow sky 氏法对神经末梢的显示.中国组织化学与细胞化学杂志.2001Vol.10(2)Jun:239-240. 20.高林波，于建云（通讯作者），石泉，等.多重脑震荡鼠平衡运动与认知行为的变化J.中国行为医学科学，2006，15（）：970-973。 21.江乐盛，于建云（通讯作者），高林波，等.多重脑震荡对大鼠8-14天空间认知行为的影响J.中华神经外科疾病研究杂志,2007，5（6）408-410。 22.李娟娟，于建云（通讯作者），郭泽云等。多重脑震荡大鼠5羟色胺能神经纤维变化。解剖学杂志，2007，30（6）753758。 23.于建云（通讯作者），李俊祥，郭泽云等。实验大鼠轻中型闭合脑损伤分级的昏迷指标与量化标准研究。法医学杂志，2008,1(24):8-11。 24.于建云(通讯作者)，李俊祥，李娟娟，郭泽云，高林波，许冰莹，吴春云。三重脑震荡鼠模型建立及组织病理学动态改变观察。中华神经外科疾病研究杂志，2010，9（4）：337-340。五、研究方案1.研究内容和拟解决的问题 研究内容 1）建立多重脑震荡（MCC）大鼠模型。 2) 多重脑震荡大鼠模型进行改良Bielschowsky还原银法染色。 3）选取合适的银染方法进行多重脑震荡后1天组、2天组、4天组、8天组、16天组、24天组、48天组、64天组大鼠皮层神经元及脑干轴索银染；与先前研究的单重脑震荡相比较，得出单重脑震荡和多重脑震荡后大鼠皮层神经元及脑干轴索银染改变的特点。 4）培养5名本科生脑震荡研究方面的知识，石蜡切片及银染方面的知识、Image-Pro Plus 6.0高清晰图文分析系统在统计结果中的应用以及统计学研究方法方面的知识。 拟解决的问题1)得出改良Bielschowsky还原银法在多重脑震荡后显示鼠脑皮层神经元及脑干轴索的优缺点。2）得出多重脑震荡后64天大鼠皮层神经元及脑干轴索银染改变的特点，并与先前研究的单重脑震荡相比较，得出单重脑震荡和多重脑震荡后大鼠皮层神经元及脑干轴索银染改变的特点。3）培养5名本科生脑震荡研究方面的知识，石蜡切片及银染方面的知识、Image-Pro Plus 6.0高清晰图文分析系统在统计结果中的应用以及统计学研究方法方面的知识。2 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（1）拟采用的研究方法、技术路线 MCC模型复制及入组实验动物标准控制： 1）对照组设置：全部试验均随机设立相等数量的大鼠作为正常对照组；全实验过程中详细统计动物死亡率及解剖记录死亡原因。2）MCC模型复制及分组：用先前研制并已反复使用的单摆闭合性大鼠脑损伤复制仪，给体重26010克的正常SD大鼠（雌雄各半）额顶部予钝性震荡打击，产生一过性意识障碍，每隔一天打击一次，共打击三天，将符合标准的大鼠随机分为1天组、2天组、4天组、8天组、16天组、24天组、48天组、64天组。3）大鼠脑震荡叛别标准：参照于建云等先前建立的大鼠轻中型脑损伤判类多元回归方程进行大鼠单纯性脑震荡类别量化判定。每次打击后必须符合以下5条定性标准：A.撞击后即刻出现一过性呼吸暂停，但不超过20秒；B.出现短暂的角膜反射、针刺疼痛反射、外耳道刺激反应消失，但不超过3分钟；C.意识恢复后无运动障碍和反射异常；D.无颅内出血；E.全脑肉眼观无损伤改变。银染样品制备：定时麻醉，经心腔原位灌注处杀固定、取脑、石蜡切片者用10%中性甲醛固定，酶标免疫组化者用4%多聚甲醛缓冲液固定。大脑再经相应灌注液固定后石蜡切片。分别自嗅束后缘、脑垂体后缘各切一刀将脑分为3块，待做银染工作。改良Bielschowsky氏银染法：1）氨银溶液配制：20 %硝酸银水溶液 30 ml ,无水乙醇20 ml ,两液混合后出现棕黄色沉淀 ,逐滴加入浓氨水 ,形成的沉淀溶解 ,再滴加 5 滴浓氨水 ,过滤后使用 ,临用时配制。2）染色步骤:切片常规脱蜡至水；蒸馏水洗 1min ,进入已先加热至 37 温箱内 20 %硝酸银水溶液浸染25 min ,蒸馏水洗 2 min；10 %福马尔林溶液还原至切片呈黄色 ,蒸馏水洗 3 min；氨银液滴染5 min；10 %福马尔林液还原至切片呈棕黑色 1 min；0.2 %氯化金水溶液调色 5 s ,蒸馏水洗 2 min；5 %硫代硫酸钠水溶液定影 2min ,水洗 5 min；乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。染色切片变化观测：对各实验组前额叶皮质、顶叶皮质、扣带皮质、基底前脑、海马、丘脑、下丘脑、基底节、杏仁核、小脑、脑干等陈述与非陈述性记忆密切相关脑区的神经元、神经轴突与突触进行显色以备体视学半定量测量。体视学半定量参数的确定：采用Image-Pro Plus 6.0高清晰图文分析系统，根据不同观察研究对象性质，分别采用神经元及其突触、神经细胞、轴突的数密度（NA）测量；轴突平均直径（D）、轴突横穿点密度（QA）测量；脑水肿细胞间隙平均面积（A）、细胞平均中心距离（Z）测量等，排除了人为影响因素。数据表达及统计学方法：所有数据均采用均数标准差(XS) 表示。数据检验应用SPSS 10.0软件包或PEMS软件包处理，组间比较采用方差分析；凡结果p 0.05被认为有统计学意义。（2） 实验方案在实验前进行预实验，由指导老师手把手教会实验操作方法；严格按照研究方法、技术路线进行操作，每次三人为一组，互相监督，确保实验的稳定性及可重复性，由指导老师全程监督实验的操作与进展。如果有解决不了的问题，及时与上级指导老师联系，确保实验能有效、真实得进展。（3） 可行性分析： 理论可行性：先前研究发现脑震荡会造成弥漫的轴索损伤，根据神经轴突损伤后华勒氏变性原理，损伤远端的轴突与突触亚细胞改变和再生修复极可能是SIS的神经病理学与康复的重要物质基础。而银染较为成熟的直观的显示神经末梢、轴突以及轴索的变化的一种方法。 技术可行性：前期的研究证实于建云课题组使用的金属单摆脑震荡复制仪及脑震荡判别方程式是相当成功的制作了脑震荡模型，而改良Bielschowsky 银染法是较为成熟银染方法，故确保了实验技术条件的可行性。3本项目的创新之处 于建云等在先前长期CC大鼠研究基础上，首次在国内建立了三重大鼠脑震荡（3MCC）模型（即每天打击一次、连续打击3次的MCC鼠模型），此模型为国内首创，具有领先的优点。 于建云等人的研究证实单重及多重脑震荡后神经元及脑干轴索有变性改变，然而对于三重脑震荡后64天神经元和脑干轴索的用银染法染色后的变化情况，至今为止还未有报道，本实验弥补了此处空白。 本实验采用Image-Pro Plus 6.0高清晰图文分析系统，根据不同观察研究对象性质，分别采用神经元及其突触、神经细胞、轴突的数密度（NA）测量；轴突平均直径（D）、轴突横穿点密度（QA）测量；脑水肿细胞间隙平均面积（A）、细胞平均中心距离（Z）测量等，排除了人为影响因素。4年度研究计划和预期进展 2013年1月2013年12月：购买实验试剂、实验动物、实验材料等，复制大鼠多重脑震荡模型，完成改良Bielchowsky还原银法染色，完成切片的制作。 2014年1月2014年12月：对Bielchowsky还原银法染色切片进行显微摄影、图文分析，得出神经元及其突触、神经细胞、轴突的数密度（NA）测量结果；轴突平均直径（D）、轴突横穿点密度（QA）测量结果；脑水肿细胞间隙平均面积（A）、细胞平均中心距离（Z）测量结果，并对数据进行统计学分析，撰写论文，结题。5预期研究成果与提交成果方式得出改良Bielschowsky还原银法显示鼠多重脑震荡后皮层神经元及脑干轴索的优缺点。得出多重脑震荡后大鼠皮层神经元及脑干轴索银染改变的特点，并与先前研究的单重脑震荡相比较，得出单重脑震荡和多重脑震荡后大鼠皮层神经元及脑干轴索银染改变的特点。培养5名本科生脑震荡研究方面的知识，石蜡切片及银染方面的知识、Image-Pro Plus 6.0高清晰图文分析系统在统计结