脓汁和粪便标本中病原菌的检测——微生物实验论文.doc

脓汁和粪便标本中病原菌的检测 摘要从脓汁和粪便标本中分离培养和检测出病原菌，根据检验目的菌的不同选用培养基，尽可能抑制杂菌，实验过程包括培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定、细菌血清学反应鉴定、细菌药物敏感性试验；脓汁标本中分离出两种革兰阳性菌呈黄、白两种颜色的菌落，且对青霉素和链霉素敏感，粪便标本中分理处两种革兰阴性菌呈紫黑和粉红两种颜色菌落，对链霉素敏感对青霉素不敏感，四种细菌均对庆大霉素敏感。关键词脓汁和粪便标本、生化反应、血清学反应、药物敏感性引言从临床标本中分离细菌的目的是为了查找与疾病有关的病原菌，这对于临床治疗及预后调查是很有价值的，在分离时我们应掌握以下原则，以便指导检出病原菌；l 了解生物在人体的分布。l 了解标本来源及临床情况l 根据标本来源和可能存在的病原菌确定选用各种分离培养基，以利于提高检出率 常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、假单胞菌、流感杆菌等。浓汁标本在做细菌分离培养的同时，均须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治依据。粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基（如SS、伊红美蓝平板、碱性蛋白胨水），尽可能抑制杂菌，以利于病原菌的检出。本实验中我们在脓汁中检出的是金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌，从粪便标本中检出的是大肠埃希菌、痢疾志贺菌，从本实验操作过程中，我们首次通过自己亲手操作从标本中提取出病原菌，并在这过程中我们学到了微生物实验中的操作技能和基本技能，树立了在操作过程中无菌操作观念，防止出现细菌污染。 材料器材：接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯 CX21型 生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子 实验方法2.1培养基的制备、消毒和灭菌培养基制备的一般程序： 调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定保存2.2细菌的分离与培养2.21 采用平板划线分离法，将取脓汁和粪便标本中混杂的多种细菌，分别在普通平板和伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37培养1824h ，从而分离出单个菌落。2.22 细菌群体生长特征的观察。观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。2.23 细菌的纯培养。脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落；粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。挑选这四种不同菌落分别在斜面培养基上接种，标记，在37培养18h。2.3细菌个体形态特征的观察2.31 取两块玻片，在每块玻片上加生理盐水34ul，2滴，在一块玻片上取黄色和紫黑菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2；在另一块玻片上取白色和粉红色菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2。经在空气中干燥后，再用酒精灯对其进行固定。2.32革兰染色。用结晶紫对以上两块玻片进行初染1分钟，水洗；再用卢戈碘液媒染1分钟，水洗；然后用95乙醇对其进行脱色约20秒钟，水洗；最后用稀释复红复染1分钟，水洗；吸干，在显微镜下镜检。2.4细菌生化反应鉴定2.41 糖发酵试验 用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中，在37下，培养24小时，观察其产酸产气情况。2.42半固体接种法 接种针斜面取四种不同颜色的细菌，各自接种进四个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 在37下,培养24小时，观察结果。2.5细菌血清学反应鉴定2.51 痢疾血清玻片凝集反应 取载玻片1张，滴加痢疾血清和生理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果。2.42 血浆凝固酶试验 取二滴兔血浆置于洁净的玻片上，分别用接种环取白色和黄色菌苔(23个菌落的菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。2.6细菌药物敏感性试验接种环分别取黄、白、紫黑、粉红色四种菌液36ul2环，各自在四个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。371824小时培养，观察结果。实验结果3.1脓汁和粪便中的细菌在两种培养基上的菌落特征结果显示：脓汁标本在普通培养基上形成白色和黄色两种菌落；粪便标本在伊红美蓝培养基上形成紫黑色和粉红色两种菌落图片略，未拍照3.2经革兰氏染色后在显微镜下的形体特征玻片一：黄色的细菌在显微镜下呈球形，呈葡萄串状排列，紫色，说明为革兰氏阳性菌；紫黑色的细菌呈杆状，粉红色，说明为革兰氏阴性菌。玻片二：白色的细菌在显微镜下呈球形，呈链状排列，紫色，说明为革兰氏阳性菌；粉红色的细菌呈短杆状，粉红色，说明为革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌3.3糖发酵试验的结果3.31紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵罐中皆变色和产生气泡。3.32粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡；在乳糖发酵罐中不变色不产生气泡。图略，未拍照3.4药敏实验结果3.41黄色细菌和白色细菌均在青霉素、链霉素和庆大霉素纸片均出现抑菌圈，其中在青霉素的抑菌圈的直径分别为29mm，32mm；在链霉素的抑菌圈的直径均为13mm；在庆大霉素的抑菌圈的直径均为17mm。3.42紫黑色细菌和粉红色细菌在青霉素均不出现抑菌圈；在链霉素出现抑菌圈，其直径为分别为15mm和16mm；在庆大霉素均出现抑菌圈，抑菌圈的直径分别为17mm和18mm。紫黑细菌黄色细菌白色细菌粉红色菌3.5血浆凝固酶试验的结果观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质；白色菌落细菌不出现凝集反应。3.6紫黑色和粉红色细菌在半固体培养基中的结果3.61紫黑色细菌在半固体培养基内呈扩散生长,培基混浊；3.62粉红色细菌在半固体培养基内沿接种线生长。 1号试管和3号试管为粉红菌生长情况 2号和4号试管为紫黑色菌生长情况 图片较模糊，结果不清晰3.7痢疾血清玻片凝集反应的结果观察到紫黑色菌落的细菌不能使痢疾血清产生颗粒性物质。实验讨论4.1实验的第一步是依据检验目的菌的不同选择不同的培养基抑制杂菌以提高检出病原菌的检出率，可见了解各种细菌的适宜生长环境对于病原菌的检测有很大的影响；分离培养出的细菌菌落可根据菌落的颜色，表面的光滑与否做出初步的判断并采取下一步适当的操作；4.2革兰氏染色法可对细菌进一步的判断，在染色过程中时间的控制很重要尤其在酒精脱色的时间把握更为严格，脱色过久过短都会严重影响实验准确性，在本实验中染色结果为黄白菌落为紫色，是格兰阳性菌，紫黑和粉红色菌落染色为红色，是革兰氏阴性菌；4.3紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵罐中变色和产生气泡，说明了紫黑色细菌都能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气。粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡，说明能分解葡萄糖，产酸不产气；在乳糖发酵罐中既不变色又不产生气泡，说明其不能分解乳糖，不产酸不产气。4.4黄色细菌和白色细菌均在青霉素、链霉素和庆大霉素纸片均出现抑菌圈，其中在青霉素的抑菌圈的直径分别为29mm，32mm，29mm，说明两者均对对青霉素敏感；在链霉素的抑菌圈的直径均为13mm，在1214mm之间，说明均对链霉素中度敏感；在庆大霉素的抑菌圈的直径均为17mm，15mm，说明均对庆大霉素敏感。紫黑色细菌和粉红色细菌在青霉素均不出现抑菌圈，说明两者均对青霉素耐药；在链霉素出现抑菌圈，其直径为分别为15mm和16mm，15mm，说明两者均对对链霉素敏感；在庆大霉素均出现抑菌圈，抑菌圈的直径分别为17mm和18mm，15mm，说明两者均对庆大霉素敏感。4.5观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明其为凝固酶阳性，是致病菌；白色菌落细菌不出现凝集反应，说明其为凝固酶阴性，不是致病菌4.6紫黑色细菌在半固体培养基内呈扩散生长,培基混浊，说明该细菌有鞭毛；粉红色细菌在半固体培养基内沿接种线生长，说明该细菌无鞭毛。4.7观察到紫黑色菌落的细