7.流感病毒抗原性分析.doc

流感病毒抗原性分析一、单向红细胞凝集抑制试验二、交叉红细胞凝集抑制测定和抗原比计算三、抗原性分析一、 单向红细胞凝集抑制试验生物安全级别与防护要求：同红细胞凝集抑制试验试验方法：红细胞凝集抑制试验，具体要求和方法同前。毒株的选择：选择全国（地方）不同时间内采样分离的流感毒株进行单向红细胞凝集抑制试验，初步分析当前流行的流感病毒的抗原性变化情况。参照血清的选择：选择国家流感中心提供的近12年的标准参照抗血清。结果判定：待分析的流感病毒的HI效价与当前流行株的标准参照抗原本身相比，其HI效价有4倍或4倍以上的差异，可以初步判定待分析的流感病毒的抗原性与当前流行株抗原间存在差别。二、 交叉红细胞凝集抑制测定和抗原比计算由于流感病毒的抗原性能经常不断地发生变异，变异程度常与疾病发生与流行强度常成正相关。因此，及时了解流感病毒抗原性变异动态，发现新变种，对流感防治及诊断均具有十分重要的意义。同时又由于流感病毒不同毒株间存在有对血清亲和性的差异，单向血抑测定很难判断新流行病毒株是否已发生了抗原性变异，更难估计出变异幅度有多大。尽管近来流感病毒分子生物学技术已得到突飞猛进地发展，但至今交叉血抑测定和抗原比计算仍为最简便，可靠和敏捷地了解流感病毒抗原性是否已发生变异，其变异幅度有多大的一种手段。交叉红细胞凝集抑制测定，每个抗原均必须准确地调至四个单位，实验必须在同一条件下进行，红细胞必须新配制的。三、 抗原性分析1. 试验方法： 红细胞凝集抑制试验2. 生物安全级别与防护要求：同红细胞凝集抑制试验3. 实验材料（以2种抗原为例）(1) 甲血清：经RDE处理去除非特异性抑制素，方法同前。(2) 乙血清：经RDE处理去除非特异性抑制素，方法同前。(3) 标准化的红细胞悬液：配置方法见同前。(4) 甲、乙抗原4. 具体实验步骤(1) 配置新鲜的4倍抗原，方法同前。(2) 根据所用红细胞选用适当的微量板2块。 (3) 于每块微量板中，除A行外，每孔加入25lPBS 缓冲液。(4) 按以下顺序，再A行各孔加入处理过的血清50l：甲血清、乙血清。(5) 用多道加样器从A行各孔分别吸取25l血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25l。(6) 每块微量板与一种抗原相对应。每孔加入25l新配制的4个血凝单位的抗原。(7) 轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。(8) 室温孵育15分钟。(9) 每孔加入50l红细胞悬液，混匀。(10) 室温孵育3060分钟。(11) 观察血凝抑制试验结果，记录血凝抑制效价。5. 抗原比计算根据实验所得数据，按下公式计算抗原比。公式：R=r1=甲血清对乙抗原的血抑滴度/甲血清对甲抗原的血抑滴度。r2=乙血清对甲抗原的血抑滴度/乙血清对乙抗原的血抑滴度。“R”代表两病毒株间抗原性差异，R=1时，表明两毒株间抗原性相同；R1.5/1或1/1.5时，表明两毒株间抗原性无明显差异；R为1:1.51:2时表明两毒株的抗原性有小差异；R值越大差异越大。如两个病毒株交叉血抑测定结果为：甲血清对甲抗原效价为1:160，对乙抗原为1:40，乙血清对乙抗原为1:1280，而对甲抗原为1: