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核酸化学1、RNA功能的多样性：1）、控制蛋白质的合成2）、作用于RNA转录后加工和修饰3）、基因表达与细胞功能的调节4）、生物催化与其他细胞持家功能5）、遗传信息的加工与进化6）、染色体、核糖体、核酸等骨架构成成分7）、信号识别与转导2、核酸碱基的理化性质：1）、弱碱性2）、紫外吸收特性：260nm3）、嘧啶与嘌呤具有疏水性4）、嘧啶与嘌呤环上的N、酮基和环外的氨基具有亲水性3、卫星DNA：主要分布在染色体着丝粒部位，由非常短的串联多次重复DNA序列组成，因为它的低复杂性又称简单序列DNA，又因其不同寻常的核苷酸组成，常在浮力密度离心中从整个基因组DNA中分离成一个或多个“卫星”条带，故称卫星DNA。4、小卫星DNA：一般位于端粒处，由高度重复序列组成的小基因簇。通常有两种形式。5、微卫星DNA：重复单位序列最短，具高度多态性，在遗传上高度保守，可作为遗传标记。6、DNA指纹：在人类中VNTRs位点是1.5kb，但人的总DNA提取后用限制线内切酶切成不同的片段，然后以ANTRs中的特异序列为探针进行southern杂交，可发现阳性片段的大小各不相同，由于不同个体的这种串联重复的数目和位置各不相同，所以VNTRs的southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，称其为DNA指纹，可作亲子鉴定。7、稳定双螺旋结构的力：1）、碱基分子内能2）、氢键3）、离子键4）、碱基堆积力5）、疏水作用8、增色效应：DNA变性后，它在260nm的吸光值会上升30%以上，这一现象称为增色效应。9、DNA具有高度弹性的原因：脱氧核糖和磷酸组成的骨架上的键可以自由的移动，随着热力学的变化，可使键弯曲、伸展或碱基分开，这就使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象的这种差异称为多态性。1）、脱氧核糖的五元环能折叠成各种构象2）、组成磷酸脱氧核糖骨架的连续的键可以转动3）、C1-N核糖键可以自由移动10、DNA构型的生物学意义：1）、沟（特别是大沟）的特征在遗传信息表达过程中起关键作用2）、沟的宽窄及深浅影响调控蛋白对DNA信息的识别，三种构型的DNA处于动态转变之中。3）、DNA二级结构的变化与高级结构的变化是相互关联的。这种变化在DNA复制与转录中具有重要的生物学意义。11、回文结构：又称为反向重复序列，是一段能自我互补的序列，即同其互补链一样的序列，能形成发卡结构或十字形结构。12、镜像重复：在同一DNA链上无互补序列，不能形成发卡或十字形结构。13、测定细胞和组织切片中核酸位置的三种方法：1）、对RNA或DNA具有专一性染色的方法：孚尔根染色法、荧光染料染色法、碱性染料染色法2）、紫外照相法：260nm下具有强烈的紫外吸收，细胞在此下照相，则含有核酸的结构很容易辨认出来。3）、经专一酶处理后染色14、稀有修饰组分的意义：1）DNA分子中的稀有组分常在基因信息的表达调控和保护中起作用。2）RNA特别是tRNA中也富含稀有成分，在RNA的功能中起作用：A、tRNA中的许多稀有组分与维持特定的三级结构、密码识别与精确配对有关。B、与细胞增殖有关C、与稳定核酸的高级结构及酶的识别有关D、与细胞癌变有关E、与基因表达调控有关。酶化学1 单体酶：由一条肽链组成，一般不需要辅助因子。2 寡聚酶：由两个或两个以上亚基组成的酶。大多是调节酶，多含偶数个亚基。3 同工酶：指催化化学反应相同，蛋白质分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。4 酶的比活力：每毫克酶蛋白中所含有的酶活力单位。5 回收率：每次提纯后酶制剂的比活力/提取液总活力。6 纯化倍数：每次提纯后酶制剂比活力/提取液比活力。7 组成酶：是细胞从恒定速率和恒定数量生成的酶类，是细胞中天然存在的，其含量较稳定，一般不受外界条件的影响。8 诱导酶：是细胞中进入特定的诱导底物后，被诱导生成的，其有无及含量的多少受外界条件的影响。9 酸碱催化：由质子转移所致的催化作用为酸碱催化作用；由催化剂向反应物提供质子为酸催化，由催化剂从反应物中夺取质子为碱催化。10 共价催化：在酶催化反应过程中，酶与底物以共价键结合成中间物过滤态以加速反应。即在催化时，亲核催化剂或亲电催化剂能分别放出点子或汲取电子，并作用于底物的缺电子反应中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价键中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。11 酶的亲核标记：根据酶与底物能特异性结合的性质，设计合成一种含反应基因的底物类似物，作为活性部位的标定试剂，它能像底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基因共价结合，使酶失去活性。12 Ks型不可逆抑制剂：这类抑制剂主要作用于酶活性部位的必须基团，但也作用于酶非活性部位，取决于抑制剂与酶活性部位必须基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及与非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故称为Ks型不可逆抑制剂。13 Kcat型不可逆抑制剂：这类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构，而且本身也是酶的底物，可被酶催化而发生类似底物的变化。但这类抑制剂还有一种潜伏性的反应基团，这种基团可因酶的催化而暴露或活化，作用于酶活性中心或辅基，使酶共价共价修饰而失活。14 酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程，称为酶分子修饰。15 化学修饰酶：在不引起酶蛋白变性的条件下，某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反应，引起共价结合、氧化、还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变，称为化学试剂修饰。具有这种性质的酶称为化学修饰酶。16 变构酶与变构调节：变构酶又称别构酶，指酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节称为变构调节，具有变构调节的酶称为变构酶，凡能使酶分子发生别构作用的物质称为别构剂，通常用小分子代谢物或辅因子。17 过滤态底物类似物：过滤态底物类似物可作为竞争抑制剂。是指底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式，由于能障小，和酶结合后紧密得多，这是酶具有高度催化效率的原因之一。1、简述酶分离提纯的一般过程及注意事项：因为酶也是蛋白质的一种，其分离提纯过程同蛋白质的分离提纯过程，一般分为：1）、前处理：包括破坏组织，将细胞的亚细胞颗粒碎片与溶液分开，并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来。2）、粗分级分离：采用适当的方法，将需要的蛋白质与其他蛋白质分开。常用方法：盐析法、有机溶剂法、等电沉淀法等。3）、细分级分离：进一步用层析法或电泳对所需蛋白质进行纯化。注意事项：1）、选材：选择酶含量丰富的新鲜生物材料。一种酶含量丰富的组织或器官往往与含量较低的组织或器官相差上千倍或上万倍，目前常用微生物为材料制各种酶制剂。2）、破碎：动物组织较易破碎，一般通过研磨器、匀浆器、高速组织捣碎机即可达到目的，微生物及植物细胞壁较厚，需用超声波、细菌磨、冻融、溶菌酶或用某些化学试剂加以破碎，制成组织匀浆。3）、抽提：在低温下，以H2O或低盐缓冲液，从组织匀浆中提取酶，得到酶的粗提液。4）、分离与纯化：酶是生物活性物质，在分离纯化时必须注意必须尽量降低酶活性损失，操作条件要温和，全部操作一般在05间进行。2、何谓酶活力：指酶催化某化学反应的能力，其大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。3、测定酶活力的原理：通过测定酶促反应的初速度来测定酶活力。酶促反应的初速度越大，酶的活力就越强，反之，反应速度越小，酶的活力越若。4、酶活性的测定方法：1）、测压法：底物或产物之一是气体或酸的，可以用测压计来测定气体体积的变化。2）、分光光度法：底物或产物在紫外光、可见光或红外光区域具有光的吸收。3）、荧光法：4）、电化学法：PH测定法、电位测定、电流测定等5）、旋光测定法：若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性6）、同位素测定法：用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物。5、温度影响酶活性的机理：1）、温度影响反应体系中的活化分子数，：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。化学反应中温度每增加10度反应速度增加的倍数称为温度系数Q10 。酶促反应的Q10为12。2）、温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速率下降。6、PH影响酶活力机理：1）、PH影响酶和底物的解离。2）、PH影响酶分子的构象。 过酸或过碱环境可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失；当PH值变化不是太剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响；Ph影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。7、酶的活性部位、特点、研究其方法、原理：与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心，也称为酶的活性部位。通常包括结合中心和催化中心两部分。特点：1）活性部位在酶分子的总体只占有相当小的部分，催化中心一般由23个残基组成，结合部位的残基数因酶而异。2）酶的活性部位是一个三维实体；可能是一级结构较远而空间结构较近。3）活性中心构象不是固定不变的。4）活性部位位于酶分子表面的疏水性裂缝中，但也含有极性氨基酸，负责结合与催化。5）底物通过次级键结合到酶上。6）酶的活性部位具有柔性或可运动性。8、研究技术和原理：1）、X射线衍射法：X射线撞击原子中电子后，产生衍射图，分析结构，把纯酶的射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X射线图谱比较，即可确定酶的活性中心。2）、切除法：对于小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关。3）、酶分子上侧链基团的化学修饰：在不引起酶蛋白变性的条件下，某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反应，引起共价结合、氧化、还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变，称为化学试剂修饰。包括非特异性共价修饰和特异性共价修饰。4）、差示标记法：利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团，然后透析出去保护剂，再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中心。5)、动力学分析法：改变PH，通过参数Vmax或Km与PH关系试验，可以提供与反应有关解离基团的pK值，可知哪个氨基酸与酶活性有关。6）、亲和标记：根据酶和底物的特异性结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能像底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。7）、定位诱变法：直接修饰基因片段或个别密码子，有目的的改变氨基酸残基，与野生型酶对比，判断被诱变残基在结合底物、催化底物反应中的作用。9、使酶具有高效催化效率的因素（酶催化机理）及机制：1）、邻近与定向效应：邻近效应是指酶与底物形成中间复合物后，使底物与底物之间，酶催化基团与底物之间结合于同一分子，使有效浓度大大提高，使反应速率大大加快。定向效应是指反应物的反应基团之间和催化基团与反应基团之间的正确取位产生的效应。邻近、定向效应影响反应速率的原因：1）、酶对底物起轨道向导作用，减少反应所需活化能；2）、酶使分子间反应分子内反应；3）、邻近定向效应起底物固定作用。2）、底物的形变与诱导契合：底物在酶中某些基团或离子作用下，敏感键中的某些基团的电子云密度增加或降低，产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生变形，底物变得接近过度态，降低反应活化能，使反应容易进行。3）、共价催化作用：是在酶催化反应过程中，酶与底物以共价键结合成中间产物过渡态以加速反应。4）、酸碱催化作用：由质子转移所致的催化作用，由催化剂向反应物提供质子为酸催化，由催化剂从反应物中夺取质子为碱催化。5）、金属离子催化：几乎1/3的酶表现活性时需要存在金属离子，存在金属离子的酶有两类：金属酶、金属活激酶，金属离子的催化相当于酸的催化，但比酸的强。A、可以通过结合底物为反应定向；B、通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；C、通过静电作用，稳定或屏蔽负电荷。6）、微环境影响：10、酶的Km值有何意义和应用：如何求？1）、物理意义：Km等于酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。2）、Km值愈大，酶与底物的亲和力越小；Km值越小，酶与底物亲和力越大。3）、Km值是酶的特征常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件有关，与酶的浓度无关。Km的应用：1）、利用已知Km和【S】，可根据米氏方程，计算V相对Vmax的%，反之，利用已知Km和V相对Vmax的%，可以根据米氏方程计算【S】。2）、判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物，就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。3）、判断在细胞内是否受【S】的调控：【S】远远大于Km，10倍以上，V=Vmax（Km忽略），为零级反应，不受【S】调节；反之，远远小于时，为一级反应，V受【S】调节。4）、判断在细胞中酶催化反应的主要方向：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。5）、推测限速步骤：6）、了解酶的底物在体内具有的浓度水平。11、酶的抑制作用类型及各类型的特点和作用机制：1）、可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。主要包括：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制作用三种。竞争性抑制是I与S竞争E的结合部位，影响了S与E的正常结合。非竞争抑制是I与S同时与E结合，但三元复合物不能进一步分解为产物，酶活性下降。反竞争抑制是E只有与S结合后，才能与I结合，三元复合物不能进一步分解为产物。2）、不可逆抑制作用：抑制剂通常以共价键与酶的必须基团进行不可逆结合，从而使酶失去活性。按其作用特点又可以分为专一性不可逆抑制作用和非专一性不可逆作用。非专一不可逆抑制：抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论必须基团与否，符合共价结合，由于必须基团也被共价结合，从而导致酶的抑制失活。专一不可逆抑制作用：抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其他必须基团，进行了共价结合，从而抑制酶的活性。12、如何鉴别可逆作用与不可逆抑制作用：除了由透析、超滤或凝胶过滤等方法能否除去抑制剂来区别外，还可以采用动力学方法来鉴别。1）、在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率，以初速率对酶浓度作图：a）在测定系统中不加抑制剂时，初速率对酶浓度作图得到一条通过原点的直线；b）在测定系统中加入一定量的抑制剂时，抑制剂使一定量的酶失活，只有加入的酶量大于不可逆抑制剂的量时，才表现出酶活力，不可逆抑制剂的作用相当于把原点向右移动；c）在测定系统中加入一定量的可逆抑制剂后，由于抑制剂的量是恒定的，因此得到一条通过原点，但斜率较低的直线。2）、如果在不同抑制剂浓度下，每一个抑制剂浓度做一条初速率与浓度关系曲线：则不可逆抑制剂可以得到一组不过原点的平行线；可逆性抑制剂得到一组通过原点但斜率不同的直线。13、细胞内酶活性调节方式：1）、变构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后，发生构象的改变，进而改变酶的活性状态。2）、共价修饰调节：通过其他酶对其多肽链上的某些基团进行了可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。3）、酶原激活：体内合成的蛋白质有时不具有生物活性，经过蛋白质水解专一作用后，构象发生变化，形成酶的活性部位，变成活性蛋白，该活化过程是生物体的一种调节机制。蛋白质1、亲和层析：蛋白质分子能对配基专一性地结合成复合物，改变条件，又能分离，利用这种特性而设计的一种层析技术。2蛋白质完全水解：即将所有的肽键都打断，使蛋白质完全裂解为氨基酸。3蛋白质部分水解：即将蛋白质的部分肽键打开，进而部分地分离出所需氨基酸。4高效液相层析：采用大幅度降低支持物的颗粒度，同时增加压力，以维持必要的流速，而设计的层析方法。5超二级结构：由若干相邻的二级结构单元结合在一起，彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件。6结构域：对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链在超二级结构的基础上组装成两个或两个以上的相对独立的三维实体，再缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体即7蛋白质的盐溶：中性盐对蛋白质的溶解度可产生两种影响，低浓度时可增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。8盐析：当盐的浓度增高时，如饱和和半饱和状态，蛋白质溶解度降低，从水溶液中沉淀出来。9密度梯度区带离心：蛋白质颗粒的沉降速度与分子大小和密度相关，在具有密度梯度的介质中离心时。质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度中。10蛋白质组：一个细胞或组织或机体所包含的所有蛋白质，现定义为基因组表达的全部蛋白质。具有三种含义：一个基因组、一种生物、一种细胞所表达的全部蛋白质。11蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。12噬菌体展示技术：是将外源的DNA通过基因工程技术克隆到噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。外源基因产物在过柱时，如柱上含有目的蛋白质，则可特异性结合相应抗体。13生物信息学：在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交差学科。是为理解各种数据的生物意义，运用数学和计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播和解析的科学。问答题：1、蛋白质一级结构测定的基本步骤：1）、分离提纯待分析的蛋白质样品2）、测定蛋白质的分子量3）、测定蛋白质分子中多肽链的数目：4）、拆分蛋白质分子中的多肽链：5）、对每段多肽链进行氨基酸组成分析：6）、鉴定多肽链的N-末端和C-末端：7）、多肽链部分裂解及肽片段的分离：8）、测定各肽段的氨基酸顺序：9）、建立完整的多肽链的一级结构：10）、确定二硫键的位置：2、测定蛋白质分子量的方法有哪些？试举三中方法说明原理：1）、根据化学成分测定分子量2）、根据氨基酸残基数估算分子量3)、凝胶过滤法4）、凝胶薄板层法5）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳6）、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法7）、渗透压法8）、超离心沉降法9）、沉降平衡法10）、毛细管电泳法11）、质谱法。3、使蛋白质沉淀的方法：1）、盐析法：中性盐对球状蛋白质的溶解度可能产生两种影响，低浓度时可增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。当盐浓度增大时，如饱和或不饱和状态，蛋白质溶解度降低，从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析的而主要作用是由于大量的中性盐的加入，盐离子与水这种偶极分子作用，使水分子活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，导致蛋白质水合程度的减少，从而使蛋白质溶解度降低。2）、有机溶剂法：有机溶剂中有较低的介电常数，根据库伦定律，介电常数降低，将增加两个相反电荷之间的吸引力。在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在，这时如果添加有机溶剂，使蛋白质溶液的介电常数减小，增强偶极离子间的静电引力，从而使蛋白质分子聚合而沉淀。有机溶剂自身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也使蛋白质分子变得不稳定而沉淀出来。3）、蛋白质沉淀剂法：向蛋白质水溶液中加入沉淀剂，使一些杂蛋白或粘多糖发生沉淀，这些沉淀物可以通过离心分离而除去。4）、等电点沉淀：不同的蛋白质有不同的等电点，利用不同蛋白质等电点的差异，调节溶液pH等于所需蛋白质的等电点，则所需蛋白质结絮沉淀。5、根据分子大小分离蛋白质的方法：1）、透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜，而小分子杂质如无机盐、单糖等能通过半透膜的性质，使蛋白质和小分子杂质分开的方法。2）、超过滤：利用压力强行使水和其他小分子透过半透膜，而蛋白质被截留在膜上。3）、密度梯度区带离心：蛋白质分子的沉降速度与分子大小和密度有关，在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度中。4）、凝胶过滤：当大小不同的蛋白质分子混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶珠网孔大的蛋白质分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠外，随缓冲液在凝胶珠之间的空隙向下移动，并最先流出柱外；比网孔小的蛋白质分子能够不同程度的进入凝胶珠网孔内，从而这些大小不同的蛋白质分子所经的路径不同，随着缓冲液向下移动，较大的蛋白质分子移动路程较短，先小来；较小的蛋白质分子移动的路程较长，后下来，从而得到分离。5）、高效液相层析：层析过程中，支持物颗粒越小，对样品分离效果越好，然而支持物颗粒过细会使流速过慢，增加纵向扩散的影响。6、根据电荷差异分离蛋白质的方法：1）、电泳：带电粒子在场中向与其自身带相反电荷的电极移动。由于蛋白质具有两性电离性质，当其溶液pH值大于等电点时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动；反之，则带正电荷在电场中向负极移动；只有蛋白质溶液的pH值在蛋白质等电点时静电荷为0，在电场中不向任何一极移动。不同蛋白质分子，由于其静电荷量和分子大小形状的不同，在相同条件下电泳时泳动速度不同，彼此可得到分离，一般来说，颗粒带静电荷越多，分子量小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则慢。2）、离子交换层析：用离子交换树脂作为介质的层析法，离子交换树脂是人工合成的，具有酸性基因或碱性基因，并具有网状结构的高聚物。当蛋白质溶液PH值大于等电点时，该蛋白质带负电荷，可结合于阳离子交换剂上；当蛋白质溶液PH值小于等电点时，该蛋白质带正电荷，可结合于阴离子交换剂上。即使带相同电荷的蛋白质分子，由于所带电荷不同，与离子交换剂的亲和力也不同，利用这种差异可以分离蛋白质混合物。7、球状蛋白的三维结构特征：1）、含有多种二元结构元件2）、具有明显的折叠层次3）、在蛋白质分子中，大多数非极性侧链总是埋藏在分子内部，形成疏水区域；大多数极性链总是暴露在分子表面，形成亲水区域。4）、大分子蛋白质常含有几个结构域，结构域划分往往与功能相关联。5）、蛋白质分子表面往往有一个内陷的空穴，空穴往往是疏水区，能容纳一个或两个小分子配体或大分子配体的一部分。8、以磺酸型阴离子交换树脂为例，试述从混合氨基酸中分离各种氨基酸的原理：1）、先用PH3.25的柠檬酸钠（或NaOH）缓冲液平衡树脂，将树脂处理成钠型。2）、将氨基酸混合液调PH至2.2，使氨基酸带正电荷3）、灌注：由于静电引力，带正电荷的氨基酸被树脂吸附，与钠离子发生交换，将钠离子换下来。4）、脱洗：用Ph逐渐升高的缓冲液冲洗，当洗脱液相继流经树脂时，由于PH不断升高，蛋白质逐渐失去电荷，因而与树脂结合能力下降，最后从树脂上冲洗下来。5）、不同氨基酸与树脂的结合能力不同，被洗脱的顺序也不相同，可逐一得到不同的氨基酸。6）、数据处理：通过测定层析图谱上氨基酸的吸收峰的面积可以确定氨基酸的含量；氨基酸自动分析仪显示各种氨基酸含量为浓度/重量，根据这个可以计算出数目。9、鉴定蛋白质纯度的方法：鉴定蛋白质纯度包含两种含义，一是鉴定是否含有非蛋白杂质，再是鉴定是否含有其他蛋白质杂质。1）、电泳法：纯蛋白质在一系列不同PH条件下进行电泳时，都以单一的速度泳动，其电泳图谱只显示出一条区带，可作为纯度的一个指标。2）、离心法：在沉降分析中，纯的蛋白质在离心力影响下以单一的沉降速度移动。3）、末端残基的确定：对于一个单肽链蛋白质或含相同亚基的蛋白质来说，通过C-末端、N-末端分折都可能只有一种蛋白质。4）、分光光度法：可检测蛋白质制剂中有无核酸存在，在测定样品的A280和A260后，纯的蛋白质应为：A280/A260=1.75 。5）、恒溶度法：纯的蛋白质在一定溶剂系统中具有恒定的溶解度。在严格规定的条件下，以加入的固体蛋白质量对溶解的蛋白质量作图，如果蛋白质制品是纯的，那么溶解曲线只有一个折点，在折点以前，直线的斜率为1；在折点以后斜率为0 。不纯的蛋白质溶解度曲线常呈两个或两个以上的折点。10、蛋白质组学的主要研究内容：1）、蛋白质组表达模式（或蛋白质组组成）的研究2）、蛋白质组功能模式（目前主要集中于蛋白质的相互作用网络关系）的研究3）、蛋白质组学研究的策略和趋势：策略包括穷尽法和差异法；研究趋势包括：相互作用蛋白质组学、亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学。11、分离技术：1）、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳：第一向进行等电聚焦电泳，根据蛋白质的等电点不同对蛋白质进行初步分离。第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照分子量不同对蛋白质进行再次分离。2）、高效液相层析：其第一向根据分子大小分离蛋白质，第二向反向层析（固定相和流动相所有溶剂相反）。12、鉴定技术：1）、氨基酸组成分析2）、氨基酸序列分析3）、质谱分析4）、翻译后修饰13、蛋白质的相互作用的研究技术：1）、酵母双杂交系统2）、表面等离子共振技术3）、噬菌体展示技术4）、蛋白质芯片技术14、酵母双杂交系统进行蛋白质相互作用研究的技术原理：酵母双杂交系统已成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法。真核生物细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子往往由两个或两个以上的相互独立的结构域组成，其中DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。理论上，任何一个AD都可以与任何一个DNA-BD结合并激活转录，即杂合的DNA-BD和AD可以组成一个具有功能的转录激活蛋白，不仅如此，只要DNA-BD和AD在空间足够的靠近，将相互分开的DNA-BD和AD在空间上使它们彼此靠近，并重建一个具有功能的转录激活蛋白。氨基酸个性研究的重要性解释蛋白质结构与功能的关系， 从一级结构预测高级结构氨基酸个性了解得越深刻，在根据一级结构预测蛋白质的立体结构时，考虑问题也就越全面，预测的正确性也就越高。维持空间构象的因素1 共价键蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或核酸）构成共价键，共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑制作用。2 非共价键生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成，而且具有选择性的识别。共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间，决定分子的基本结构，是分子识别的一种方式。而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。1)静电作用静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的各种静电吸引力。酶、核酸、生物膜、蛋白质等生物大分子的表面都具有可电离的基团和偶极基团存在，很容易与含有极性基团的底物或抑制剂等生成离子键和其它静电作用（1)离子键生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。(2)离子偶极作用分子中O、S、N和C原子的电负性均不相等，这些原子形成的键由于电负性差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用.离子-偶极相互作用一般比离子键小得多，键能与距离的平方差成反比，由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会影响作用强度。(3)偶极-偶极相互作用两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极两个偶极间的作用。偶极偶极相互作用的大小，取决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置。这种相互作用在水溶液中普遍存在。它的作用强度比离子偶极作用小，但比偶极诱导偶极作用大2)氢键氢键的形成 氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊形式的偶极偶极键。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。 氢键的大小和方向 氢键的键能比共价键弱，比范德华力强3)范德华力这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.40.6nm时，这种力就表现出较大的集合性质。范德华力包括引力和排斥力。4)疏水作用疏水作用是指极性基团间的静电力和氢键使极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团相互聚集所产生的能量效应和熵效应。蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域，这是由构成它们的氨基酸侧链上的烷基链或苯环在空间上相互接近时形成的。高分子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构蛋白质的时空特性1.蛋白质的空间性 信号肽对蛋白质或肽链的定向传送已成为蛋白质研究的一个很重要的方面。 特征结构：溶酶体酶分子中的甘露糖-6-磷酸 酶原及酶原激活 同形异位突变2.蛋白质的时间性 肿瘤发生时出现胚胎分化早期所出现的Pr，如肝癌出现的甲胎蛋白。 细胞周期不同时期蛋白质表达的调控是又一个重要研究领域。分离纯化依据的性质1大小蛋白质的大小各不相同，可从含几个氨基酸的小肽（几百个Da）至含10 000多个氨基酸（上百万个Da）的巨大蛋白质不等。多数蛋白质的分子量在10 000150 000Da之间。2形状蛋白质形状有近似球形的，也有很不对称的。在离心、凝胶过滤或凝胶电泳过程中都会受到形状的影响。3电荷蛋白质的静电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷的总和。一蛋白质中，若天冬氨酸和谷氨酸残基占优势，在pH7.0时带净负电荷，则称之为酸性蛋白；若赖氨酸和精氨酸残基占优势，则认为是碱性蛋白质。4等电点等电点（pI）是蛋白质上净电荷为零时的pH值，由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基数目和滴定曲线所决定。5电荷分布 电荷的氨基酸可均匀地分布于蛋白质的表面，亦可成簇地分布，使某一区域带强的正电荷而另一区域带强负电荷。这种非随机的电荷分布可用来通过离子交换层析来分离蛋白质。6疏水性多数疏水性氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些可见于表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分级分离的能力。7溶解度蛋白质在不同溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（300 mg/ml)不等。影响蛋白质溶解度的因素包括pH、离子强度、离子的性质、温度和溶剂的极性。蛋白质在其等电点处一般较不易溶解8密度 多数蛋白质的密度在1.31.4g/cm3之间。分级分离蛋白质时一般不用这个性质。但是，在含有大量磷酸盐（如卵黄高磷蛋白，密度为1.8）或脂质部分（如脂蛋白，密度为1.03）的蛋白质，与一般蛋白质在密度上确有不同，可用密度梯度法将它们从大部分蛋白质中分离出来。9配体结合能力 有许多酶能相当紧地域底物、效应分子、辅助因子和DNA模板。可利用亲和层析分离10金属结合能力 有许多酶能与某些金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+)紧密结合。主要是其半胱氨酸或组氨酸残基可与金属离子作用，可通过金属离子螯合柱将酶固定11可逆性缔合 在某些溶液条件下，有一些酶能聚集成二聚体、四聚体等。如大肠杆菌RNA聚合酶在0.05mol/L NaCl溶液中形成二聚体，在0.3mol/L NaCl溶液中为单体，可利用这一性质，相继在不同条件下按大小进行分级分离。12. 翻译后修饰 许多蛋白质在合成后要通过加入糖基、酰基、磷酸基团或种种其他部分来进行修饰。这些修饰提供了可用于分级分离的依据。如糖蛋白能与含有外援凝集素的柱子结合，外源凝集素是一类能牢固地与某些糖基部分结合的分子。13. 特异性序列或结构 氨基酸残基在蛋白质表面上的精确的几何表象可用来作为分离方法的基础。例如，常可得到只能识别蛋白质上的特定部位（表位）的抗体。把只能与待分离蛋白质结合的单特异性抗体连接于填料上，可制备成免疫亲和柱。14. 非寻常性质 除上述各种性质外，某些蛋白质还有一些不寻常的性质，如不寻常的热稳定性、抗蛋白酶解的抗性等。例如大肠杆菌碱性磷酸酯酶的纯化，将细胞提取物加热后离心去除凝结的蛋白质，然后用蛋白酶处理含有磷酸酯酶的上清液，该酶消化剩余的杂蛋白，留下基本纯净的碱性磷酸酯酶。15.基因工程构建的纯化标记 随着基因工程技术的进步，克隆编码某一蛋白质的cDNA已变得比较容易。通过改变cDNA而在被表达蛋白质的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的“标记”可用来作为一种有些的纯化依据。最通行的标记之一是在蛋白质的氨基端加上610个组氨酸，这样可以使肽链能与Ni2+螯合柱紧密结合，经洗脱，再用游离咪唑洗脱或通过将pH降至5.9，使组氨酸充分质子化，与Ni2+分离而使蛋白质得以纯化。分离纯化的一般步骤（一）前处理1、选材2、破碎3、混合物的分离植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。（二）粗分级分离（1）盐析（2）等电点沉淀（3）有机溶剂分级分离（4）超滤（5）凝胶过滤（6)冷冻干燥当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。（三）细分级分离 一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。3.细分级分离结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 4. 结晶方法(Crystallization Techniques) 4.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2l包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。 4.2 液-液扩散(LiquidLiquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约5l）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。 Garc?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。 4.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion） 4.3.1 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10l蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封（如图3）。 4.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在悬滴法中，如果蛋白质溶液表面张力很小就会在盖玻片表面展开。此时，沉滴法更有利，图4给出了沉滴法的简图。 4.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白质结晶的方法，还有许多透析技术。透析的优点是沉淀溶液容易改变，对于适量的蛋白质溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如图1.5a）。透析膜通过橡皮圈连在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮约10min。对微升量的蛋白质溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛细管（Zeppezauer method）或者树脂玻璃纽扣（如图1.5b）。纽扣的缺点是纽扣中的蛋白质晶体不能通过极化显微镜观察到。 另一中微透析方法在图1.6中有描述，将5l蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的Eppendorf管中。依据电荷不同的纯化方法1. 电泳概述 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)，也称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳 (disc gel electrophoresis)，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯Ift胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分是分离胶），这二部分凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度,pH以及电场强度都是不同的，即不连续的。这样,电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带（厚度约为0.1 mm），然后再进行电泳分离。PAGE是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。 化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED 光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED 不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。3. 毛细管电泳毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（f2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。 毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、 DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。通过施加10-40kV的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。现在，HPCE已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。人类基因组工程中DNA的分离是用毛细管电泳仪进行的。4. 等电聚焦原理: 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合