基因表达载体构建.doc

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。1原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： （1）结构基因均有调控序列； （2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。2不同点：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。 真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：（1） 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。（2） 插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。 二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？1意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。2主要环节：（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。3异同：目的基因功能与表达分析主要是为了研究目的基因的表达情况以期为基因工程应用打下基础；基因工程则是将目的基因应用于实验对象上以期获得相应的产物或者实验现象。根癌农杆菌Ti质粒有什么特点？如何构建农杆菌Ti表达质粒载体？1.Ti质粒可分为4 个功能区域：T-DNA区(transferred-DNA region)：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA；Vir 区(virulence region)：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性；Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移；Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。 2. 农杆菌Ti表达质粒载体的构建（1）野生型Ti 质粒的改造野生型Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面：删除T-DNA上的tms、tmr和tmt 基因；加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；引入植物细胞的筛选标记基因，便于转基因植物细胞的筛选；引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆；除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。（2）中间载体的表达构建 为了使Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将T-DNA片段克隆进大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌农杆菌的Ti 质粒。带有重组T-DNA的大肠杆菌衍生载体称为中间载体。在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子，主要包括组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子三类，它们可使外源基因在植物细胞中表达；当启动子与显性选择标记基因及报告基因连接，构成嵌合基因时，这些标记基因同样能表达，从而可提供用于筛选和鉴定的表型。（3）植物表达载体的构建 中间表达载体不能将外源基因转化进植物细胞，因此，必须将中间表达载体引入到上述已改造的受体Ti 质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体(它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基因转化中应用。为利用根癌农杆菌的Ti 质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与Ti 质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti 质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA 重组分子就可整合到植物细胞染色体DNA 上。最后利用植物选择标记基因筛选转化细胞。双元载体系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。其中之一是含有T-DNA转移所必需的Vir 区段质粒，它缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活T-DNA 的转移，故称为辅助Ti 质粒(helper Ti plasmid)；另一个则是含有T-DNA的质粒，一般作为目的基因的载体，由于其分子量较小，故称为微型质粒(mini-Ti plasmid)。它是一种寄主范围广泛的DNA转移载体质粒。它既含有大肠杆菌复制起始位点，又含有根癌农杆菌复制起始位点，实际上是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。这两种质粒在单独存在的情况下，均不能诱导植物产生冠瘿瘤。若根癌农杆菌细胞内同时存在这两种质粒时，便可获得正常诱导肿瘤的能力。因此，含有双元载体的根癌农杆菌细胞浸染植物时，就可以将含有目的基因的T-DNA整合进植物基因组中。目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti 质粒介导的双元载体系统。首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌后，再导入携带辅助Ti 质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti 质粒上的vir基因，随后将微型质粒上的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。三、植物病毒表达载体有什么特点？有哪些应用？1植物病毒表达载体的特点：（1）病毒增殖水平较高，可使伴随的外源基因高水平表达；（2）病毒增殖速度快, 外源基因在很短时间可达最大量的积累；（3）病毒基因组小，易于进行遗传操作，大多数植物病毒可以通过机械接种感染植物，适于大规模商业操作；（4）宿主范围广，一些病毒载体能侵染农杆菌不能或很难转化的单子叶、豆科和多年生木本植物，扩大了基因工程的宿主范围；（5）病毒颗粒易于纯化，可显著降低下游生产成本。2应用：植物病毒作为高效表达载体的用途包括多个方面，如用于病毒病理学研究、基因表型研究、病毒在植物细胞内转移的研究等，而最有价值的用途是用于商业生产一些蛋白质或多肽，尤其是利用植物病毒作为表达载体系统生产疫苗或药用蛋白。这种基因工程植物病毒还有可能作为口服疫苗，与以往的蛋白或疫苗生产方式有很大的不同，如除了成本较低外，安全性方面也有较大的优势。随着载体构建策略的不断完善, 多种病毒将被用于构建不同类型的载体，从而表达各种不同目的的外源基因，同时更多的医用蛋白或疫苗将在植物中得以表达，植物将有望成为生产各种不同用途的外源蛋白的大型生物反应器。资料表明，CPMV和TMV 融合抗原表达载体可以大规模生产小分子多肽。杆状单链正义RNA 病毒如TMV、PVX 和TEV 等可以用来表达较大的蛋白多肽，而且操作方便，复制表达水平高，表达载体稳定。此外，个别TMV、PVX 和PVY 既可以侵染单子叶植物也可以侵染双子叶植物，扩大了寄主范围，适宜不同地域范围内发展。四、什么是RNAi现象？其分子机制是什么？可能在植物基因工程的有哪些用途？1RNAi即RNA干扰,是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。2分子机制：病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。3用途：植物RNAi具有特异性、高效性、系统性以及可遗传性等特点。可利用RNAi技术进行基因功能研究的初步筛选，直接利用RNAi创造的特殊性状变异体进行植物改良，时在植物发育的不同阶段抑制特定基因的表达,对发育生物学研究也具有重要意义。五、根据植物基因表达载体构建的几个例子，谈谈基因构建中一般从哪些方面着手，如何构建，才能获得恰当高效的外源基因表达载体。1. 外源基因的表达效率启动子的强弱。有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。因此，选 择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。最理想的可调控启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起 细胞死亡等问题。当细胞数目达到一定的密度，通过多种诱导(如温度、药物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。核糖体结合位点的有效性。SD 序列是指原核细胞 mRNA 5端非翻译区同 16S rRNA 3端的互补序列。按统计学的原则，一般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列中的 4 个碱基。SD 序列的存在对原核细胞 mRNA 翻译起始至关重要。SD 序列和起始密码子 AUG 的间距。AUG 是最首选的起始密码子，GUG、UUG、AUU 和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。另外，SD 序列与起始密码子之间的距离以 93 为适宜。密码子组成。尽量避免使用罕用密码子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等。2. 表达质粒的拷贝数和稳定性 多数情况下，目标基因的扩增程度同基因表达成正比，所以基因扩增为提高外源基因的表达水平提供了一个方便的方法。对于原核和酵母表达体系而言，选择 高拷贝数的质粒，以其为基础，组建表达载体。表达载体的稳定性是维持基因表达的必需条件，而表达载体的稳定性不但同表达载体自身特性有关，也与受体细胞的 特性密切相关。所以在实际运用时，要充分考虑两方面的因素而确定好的表达系统。利用选择压力、尽量减少表达载体的大小、通过建立可整合到染色体中去的载体 等待方式，可以增加表达质粒的稳定性。3表达产物的稳定性组建融合基因，产生融合蛋白。融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性降解。这种通过产生融合蛋白表达外源基因，特别是相对分子 质量较小的多肽或蛋白编码的基因，尤为合适。产生可分泌的蛋白。如将外源基因表达产物分泌到大肠杆菌细胞的周质或直接分泌到培养基。外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达，这种不溶性的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，有可能减弱表达产物的降解。采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性。4. 工程菌的培养条件由于细菌在100L以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下200mL摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模 培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺方面的因素也包括生物学方面的因素。工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生 物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。生物学方面的因素包括多方面，首先是与细菌