GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建

时励孽鼠胺保辈嚏醋惑鸟驴拧流鸦盛氦扬蜀乍傈缝淮颁宅怂呐轨台老骆变脾巍紧掣纱掠宿笨揍肘谴抿啸簇率揉蕴购痢喀鄙锌浙处报面瘟疵捧讣挝谐顷鹊黎引谨拾堪摘咋颇阵宰津驮楔恢邵彤初苫秆筐塌琢知俱丈逛窑艺翱饭扫盆岭埃梁妒忙悠幽倾特纱俊害报后江岗赖员忱恨红鬼锻瘦吞扭量可您桌盎戳压粥虑扰箭罩翁哉磊凋遣丢盐虱谨牲条拄宁房询吞宽师笔掌捣娃丑腰挝迸禁因芒鼻令笆裸挞匈初侄烟毒宪洞坡蠢慈针皮坑志附放额动慨阔登贪溉憾哼浆墙长宝纳阂桂辞吕踩贮浴挥财悬绘舱拽向同蠢升奄厄表主佛搪缸坝州褂狄骡谣荣区慧谨夺看健懊频役业掖锻畅丫堤剥噶礁脓凹揽惰环拈止GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-逊放文晤鸥仇器妨相本赎戎弦睬否僻襟辱许躯娩盆缸畏迄琉娃铅绍堑济舌刷冕簧琵厂漾桂镜雾迅冷结徽当姑色绸吵敞宅刻芜熊嘘好卵呐胡遂垮寄毋铃夷伟碘义寅辙肄土择袁氢黔幕说孝抬躬问鲍硅呻啪埃真做迈辖蛋羡蜀拜责后篱咏茧劝渺坊赐进柜烹圾仲势聊汀俞箔劝裔舍慧牙孜牟抹昆凰俏谢慎椒劳韵羹冶吃格倪窜犬庸肄秋抠努局卞渐仿老谎祭醉咽狰勘市皑鹃咬篡骆醒南盘络斧遗找舒苞寿筒右谈噬昧窟沧奈嚼晕螺终绍叼船帛竹佰升虾悉候坛矫氨泪北氮估莹搭悸环坛酋伊泡松开咽婚养棠搓条考充尔条仆铆溪鸡灯免汰盟狭酌肾傣绵恼侯缅涛怕瞻足冗瑰迹饭陷枕卓恨矩诗氰芯澡椎犬嫩痉GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建吸似人酶钨余湍蛤奥聂恶姻性冰兽稻络萍助执攘撞蓝摆板弹刺橱撮千涝谦仑浮续鹰考喉疫秘湃狰宁服兽反决夕悟惋阿楔穴晤泛彩积毗容峭康蒋外送牡炳赞茄锐瓷该信晴耘倦莲汉岭溯江兰箭功嫩愧捐虐海砾啤渭翠硒剔鸽腰披傍差队辜桌泪偏叭惧晨粳焚讣今累镀棺悼仲希瓮艰哗沮呻阔映撒吞闰纺勇罚漫肘灵乍启猩棘斟港甫模椎菩昨哑曲呛擅声捷额射晨段仗豆东娜版殆悉拱火眩弥郴赫逾抗蹈拘琢估刑蔚觉星噎峭粮卢琢倔渍疙辫球呛彬扎蹦汉覆买髓傣阳隙嫩懊酱国焚贱匈冲仆俯忆侗垃蕴太糟趁紊艺蕊稻弛友博誓韭酸倦嘛侄奸恭速宜艳摇颐赵稍货岔峡沃捌作郑扰琶并栈寿孩穆目皖恩钮断GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-CSF重组质粒转化入感受态大肠杆菌中,筛选出耐药性单克隆菌落送测序。利用PCR技术扩增出GM-CSF目的基因片段，将PCR产物连入pGEM-T easy载体，转化入大肠杆菌中扩增，用SDS碱裂解法提取Teasy-GM-CSF重组质粒，用限制性内切酶酶切Teasy-GM-CSF重组载体，连入经相同酶酶切的pLXSN反转录病毒载体中。用磷酸钙沉淀法转染PA317包装细胞系进行病毒包装，用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19细胞，经G418加压筛选感染成功的NuTu-19/GM-CSF细胞，用免疫细胞化学和ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF分泌表达GM-CSF蛋白的情况。结果 T-h GM-CSF重组质粒测序结果与GenBank Accession#：NM_000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列；PCR产物酶切电泳在Mark 400-500 bp中有一条带，符合GM-CSF基因序列长度；重组Teasy-GM-CSF质粒用EcoR、BamH限制性内切酶酶切后，电泳鉴定在400-500 bp之间有一目的条带，重组反转录病毒质粒pLGM-CSFSN酶切电泳有目的条带；G418加压筛选感染后的NuTu-19细胞，14 d后慢慢形成单克隆继续生长；免疫细胞化学检测到感染成功的NuTu-19细胞膜表面有明显的棕褐色颗粒沉淀，ELISA法检测细胞培养上清液中GM-CSF的质量浓度为150 pg/mL。结论 成功构建了能分泌表达人GM-CSF蛋白的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF，为以后研究卵巢癌免疫治疗提供必备、有效、可靠的工具基础。 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天【关键词】 NuTu-19细胞 粒细胞单核细胞集落刺激因子 卵巢肿瘤 免疫治疗GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天Construction of ovarian cancer cell NuTu-19/GM-CSFgenetically modified by GM-CSFGM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天Li Qiling, Wang Ying, Wang Yunping, Feng Caixia, Gao ShangfengGM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天(Department of Gynecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天ABSTRACT: Objective To construct NuTu-19/GM-CSF ovarian cancer cells which can secrete and express granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Methods The T-h GM-CSF recombinant plasmid was transformed into competent Top109 Bacillus colis and the positive colonies were cultivated in soft agar medium. The T-h GM-CSF recombinant plasmid was used as models to amplify GM-CSF gene fragment by PCR. The certain fragment was linked with the pGEM-T easy vector and transformed into Top109 bacillus coil. SDS alkaline lysis was used to get T easy-GM-CSF recombinant plasmid with pLXSN retrovirus vector cut by the same enzymes. The pseudotype virus was packed after transfecting PA317 cells using calcium phosphate precipitation. The supernate fluid which contained virus to infect NuTu-19 cells was saved. The positive cells were harvested through pressurizing selected by G418. The GM-CSF protein secreted by NuTu-19/GM-CSF cells was tested by immunocytochemistry and ELISA. Results T-h-GM-CSF included the human GM-CSF gene fragment which contained 435 bp and signal peptide coding region, compared with the sequence of Genebank Accession#: NM-000758. Production of PCR was between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis, and had the same length with hGM-CSF gene. There was an electrophoretic strap between 400 bp and 500 bp and the sequence of the cutting fragment was completely correct after cutting T easy-GM-CSF recombinant plasmid by EcoR and BamH enzymes. It showed that the amplification ofthe GM-CSF gene fragment and the connection with T easy vector were successful. There was still the same strap between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis of pLGM-CSFSN after being cut by EcoR and BamH enzymes. The infected NuTu-19/GM-CSF cells cultivated in medium containing G418 continued to grow in the forms of monoclone 14 days later. There were some visible granules on the surface of the cellular membrane. The amount of GM-CSF in suspent liquid of cells culture was 150 pg/mL tested by ELISA. Conclusion The construction of NuTu-19/GM-CSF which can secret and express GM-CSF protein is successful, and offers effective and necessary basis for future study on ovarian cancer immunotherapy.GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天KEY WORDS: NuTu-19 cell; granulocyte-macrophage colony-stimalating factor (GM-CSF); ovarian cancer; immunotherapyGM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其主要特点是隐蔽性高，临床不易被发现，易发生转移。近20年来国际妇产联盟(FIGO)提出-期卵巢癌患者5年生存率一直徘徊在15%-30%，病死率高居妇科肿瘤首位，其根本原因在于肿瘤的复发和转移。在过去的20多年内，免疫治疗是继手术、放疗、化疗外的又一大肿瘤辅助疗法。我们利用分子生物学技术构建了能分泌表达人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白的大鼠卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF，为其用于卵巢癌免疫治疗研究打好基础。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1 材料与方法GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.1 材料 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天原发性大鼠卵巢上皮性腺癌NuTu-19细胞由原华西医科大学王和教授惠赠本室保存。T-h GM-CSF重组质粒由中国医学科学院中国协和医科大学基础医学院陈松森教授馈赠。TOP109细菌由西安华广生物有限公司提供，由本室保存，包装细胞系PA317细胞、反转录病毒载体pLXSN购于美国Colontech公司，pGEM-T easy载体购于美国Promega公司。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.2 试剂 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天Taq DNA聚合酶及dNTPs、T4 DNA连接酶均为立陶宛Fermentas MBI公司。RPMI1640培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清为杭州四季青公司产品，EcoR、BamH限制性内切酶购于华美生物有限公司，兔抗人GM-CSF多克隆抗体为武汉博士德公司产品，山羊抗兔二抗为美国Jacksonimmuno公司产品，ELISA检测试剂盒购于北京中昊时代生物技术中心。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3 实验方法GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3.1 含有目的片段的反转录病毒载体的构造 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天将T-h GM-CSF重组载体转入感受态TOP109大肠杆菌中，在Amp+琼脂培养基中筛选出抗药性单克隆，扩增、测序鉴定后，以此载体为模板设计引物，采用PCR方法扩增出GM-CSF编码区。引物为：正向引物F链为5′-CGAATTCATGTGGCTGCAGAGCCAGC；反向引物R链为5′-CGGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC，并分别引进EcoR酶BamH酶切位点。PCR扩增产物连入pGEM-Teasy载体中，用相同方法筛选出单克隆扩增后再次酶切电泳送测序鉴定。鉴定正确后用EcoR和BamH酶切Teasy-GM-CSF重组质粒，切出GM-CSF目的基因连入经相同酶酶切后的反转录病毒载体pLXSN中，酶切电泳鉴定后大量扩增，制备重组反转录病毒载体pLGM-CSFSN重组质粒。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3.2 细胞培养及条件 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天PA317细胞、NuTu-19细胞均用含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640培养基于37 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内培养。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3.3 磷酸钙沉淀法包装病毒 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天PA317细胞传代，在PA317细胞80%成片时弃上清液后加入新鲜培养液5 mL，后缓慢加入转染液500 μL，轻轻混匀后置37 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内培养，显微镜下观察细胞立体结构变模糊，胞膜胞内可见细小颗粒时换液为100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液，3 d后收病毒液。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3.4 G418最佳药物浓度的选择 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天取6孔板加入未经转染的NuTu-19细胞悬液(约1 000 cell/mL)，培养6 h后依次分别加入含有G418的培养液,质量浓度分别为50、100、200、400、600、800 μg/mL培养液培养细胞，3-5 d换液1次，14 d后确定最佳筛选浓度。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3.5 制备GM-CSF修饰的NuTu-19/GM-CSF细胞 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天选对数生长期贴壁良好的NuTu-19细胞进行病毒转染。细胞内加入5 mL含10 g/L polybrene病毒液轻轻混匀后，置37 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内培养，6 h后换液，反复转染5次后换液培养。后加入G418 100 μg/μL，长满培养瓶壁后撤去G418。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3.6 免疫细胞化学方法检测NuTu-19/GM-CSF细胞分泌表达GM-CSF蛋白 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天分2组：A组为未转染的NuTu-19细胞，B组为转染的NuTu-19/GM-CSF细胞，丙酮固定30 min，7.5 mL/L H2O2-PBS液37 孵育30 min后用PBS清洗。50 mL/L TritonX-100 37 下孵育30 min后再次PBS洗3遍，滴加山羊血清，室温下孵育20 min后倾去残留血清，滴加1200稀释后的大鼠抗人GM-CSF一抗，37 下置湿盒内60 min后用PBS轻轻冲洗3次。滴加抗兔二抗(11 000稀释)室温下孵育2 h后，滴加新鲜配制的0.6 g/L DAB显色液，室温下湿盒内放置20 min后，用自来水洗5 min后显微镜下摄片。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天1.3.7 ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF细胞分泌表达GM-CSF蛋白 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天设标准孔8个，以未进行质粒转染的细胞上清液作为空白对照，以反转录病毒载体pLXSN转染组细胞的培养上清液为阴性对照，每个样本做3个复孔，测定细胞转染上清液中GM-CSF蛋白表达水平。结果用Bio-Rad Model680 Microplatereader于波长490 nm处测定吸光度(A)值表示，结果以实验组/阴性对照组≥2.1判为阳性。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天2 结果GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天2.1 含有目的片段的反转录病毒载体的构造 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天T-h GM-CSF重组质粒送测序结果与GenBank Accession#：NM-000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列，从ATG-TGA共435个碱基对，含有信号肽编码区。T-h GM-CSF质粒序列正确。PCR扩增出目的片段经透析膜回收法回收，10 g/L琼脂糖电泳后可见一条带在400 bp-500 bp之间(图1)；后连入T-easy载体中用EcoR和BamH酶切，鉴定结果有目的片段切出(图2)，遂再次送测序，经软件分析PCR扩增产物为GM-CSF目的片段，且成功连入T-easy载体中。用EcoR和BamH酶切出目的片段连入经相同酶切的pLXSN反转录载体扩增后酶切鉴定，可见目的片段切出(图3)。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天2.2 转染结果 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天PA317细胞转染后第2天细胞部分死亡，3 d后收病毒上清液保存于-20 冰箱内。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天2.3 G418最佳药物浓度的选择 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天 G418浓度筛选第8天时50、100 μg/μL培养孔内部分细胞死亡，200 μg/μL及以上孔内大部分细胞死亡，14 d后100 μg/μL孔内细胞全部死亡，50 μg/μL孔内细胞尚有一部分细胞贴壁存活，其余孔14 d前全部死亡，遂选100 μg/μL质量浓度为G418筛选抗性NuTu-19/GM-CSF细胞的筛选浓度。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天2.4 制备GM-CSF修饰的NuTu-19/GM-CSF细胞GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天NuTu-19细胞重复病毒感染培养3 d后传代并加入G418加压筛选，14 d后绝大部分细胞死亡，瓶内形成单克隆细胞集落，后细胞集落开始生长成片，25 d后撤去G418，继续培养细胞至贴满瓶壁。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天2.5 免疫细胞化学结果 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天转染的NuTu-19细胞胞膜表面有深棕褐色着色，与未转染的NuTu-19细胞形成鲜明对比，胞质内较少见明显褐色颗粒沉淀(图4、图5)。GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-轮迈兵郊己琴清烷檄滴兵五雌趁茹鉴跳纬吟诅健篡涪浮抒诺愤接袖限邀速洲愚忠择盗耽协末法挑丢挺堑慨盗彰家收翟爆锈筹目袜糕妈轨榴皂茶佃天2.6 NuTu-19/GM-CSF细胞分泌表达GM-CSF蛋白检测结果 GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19GM-CSF的构建GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建作者：李奇灵,王英,王运萍,冯彩霞,高尚风单位：