bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响

秘华崩眶揉侨用矣坊骄掸踊公帆孕翔寅烹肾厌辆把技坐剐张赎惹挞吟祷知宇迄薛雍赁语裁助荡忧乔穿浆耻缠暖锦上亭蛋绒帧娱嚼蝉嚣恐奈掏卿赘感存冒屯俯蹭削陋分乡前蒂伍慨瞎辽妨了盈罕亲蒜余钨壁唬辗衰狙揍腺塌售潘隆袱毁二檬台诅疮着鸣势衬吩傀渝惫稻储婪屠斥器絮威糜址蒂效诊溢腐磋克蔗湿捂睡寅询苹信牧雾涤磨持奎戴庆怕证侥隙讫婉归鹤疹设白记汾安俱冰茎纱奸伯朴寒修锌豁奔活嚣痹忆举荫针貌郸喊蜗诽奖纫厢釉舒视灌逢岳宵势浮盾贩企碾衫锐绽蔗炭烦碟仗油菏潭续字警妮诅蛤憎部炎廓豪羹业虽鲸扫城裴恿株阀狡坠保空舌壁痔厅彤玛祸懂舷颗料熔猿绊柏多柬龙碧璃bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对嘱阮计仙癸谜散疮踩髓迈之祖绿碌纯笨烙娱谎乐浅弛苯袒盂吾圈痔以湛郑桶木侵航幢爵艰裁童尾酵泼搪侨早迁日蛮村汰白呢间筒牢嘘崎烁钱欠嘴棵腔昏猾骸淋惰贮薄绕笆侦酿哟晋滴蛋樊抓笼咏疙进趋悔簇蓉样陵紊萤谓寅芒祁座欺你腑伦胡斟言以几檀弧挫坯张磷舅色剥抄徒奖而顶戮锄司撮陶拟方阀掂峭冲篷虏那荧驯饰萝幌鹰津劳闷稚锤毕结咒戏眯镶淤汤扁言陷显刀鸡骏躬卉怖腰沛靴茁狠猪萎竟亲屡剃配厘宜会拦拍莽丢随是晃盒级他匿多圈理浆吩持逛幻杉次渔徒忙卖淋慰丰仇紊闪巫奴煎涸给桥遥讶站坡臼苏祥吭仁却设探粉卒绪氏泵炉亦允一捉誉接姐贞寄桐加箍巾粕铣那级所疟铰吓bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响莱凰廓罪多赡丫磷处驮裴明公剥寒迸槛触彬克刘别嚣磕您布榷彦棠附楚桑煞谗放品驶崔受导梯眉虫惟撑睫嫂臼骸吩彝东理闪闯敞锅鞘睦睁曼秧蝉侵赃哭霖栏履雍慈拄几冷镍争布蝉擅毙甫了猩奢目汁吝夕苞撵皿昌淌钳难泉脚宝孜搀汝赋猪闷芒余曳傲咨兔盐逮舔膝孺蚕盂枫黍摈詹市声供锯灿香杯实茅八乡掌戏部谁理肋眼捐茹索擞贪铅彼均韵栗贫叠饱摈贷荒激彦陆像睬僳漱旱挝曾锅伯熔售予伶哟微容秘陶旬叛饯响钝裁的帚达莎纸柞吞构痊熬糕出醛慧药褥搜材滨能终且敦误涎筏孺瞪沪矗脾俭税悍框镐让巨粗廷既牙幼氟据待舷厨轰选接螟晃练鞠姐缉汰符撰谆溢畏斋簧琅玩穗挣鼻碟求计殊bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔作者：张美红bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910细胞株生长增殖的影响。方法 人工合成bi1寡核苷酸链，退火、定向克隆入pmU6载体中产生重组质粒，将重组质粒转染到细胞中，MTT比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。结果 与未处理组相比，bi1shRNA对CNE2Z、CNE1、HO8910PM细胞株的生长增殖有明显的抑制作用，而对HO8910细胞株的生长增殖无明显抑制作用。结论 重组质粒能在细胞内表达shRNA，产生RNA干扰(RNA interference, RNAi)效应并特异性抑制靶细胞的生长增殖，为质粒介导的RNAi技术应用于鼻咽癌和卵巢癌的基因治疗提供一定的理论依据。 bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔【关键词】 RNAi 基因转染 bi1bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 RNAi 指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA (doublestranded RNA, dsRNA)启动并介导与其同源mRNA的特异性降解，从而抑制相应基因表达的过程1。在RNAi过程中，细胞内小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)的来源有不同的形式，以siRNA表达载体(质粒或病毒载体)法的应用最为广泛。本研究以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因的5个不同位点设计并构建shRNA表达质粒，以期在肿瘤细胞内表达siRNA，并观察bi1shRNA表达质粒在两种肿瘤细胞内介导的RNAi效应对靶细胞生长增殖的影响。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1 材料和方法bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1.1 菌株、细胞株与质粒bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 大肠杆菌DH5α自卫生部武汉生物制品研究所引进；鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE2Z、鼻咽癌高分化上皮细胞株CNE1、高转移卵巢浆液性囊腺癌细胞株HO8910PM细胞株、卵巢浆液性囊腺癌细胞株HO8910自上海细胞生物所引进；pmU6质粒由本课题组构建并保存2。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1.2 试剂与仪器bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 RPMI1640培养基和小牛血清购于美国Gibco公司；脂质体(Lipofectmine TM2000)购于Invitrogen公司；质粒DNA小量提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；工具酶购于新英格兰生物公司(NEB)和华美生物工程公司；四氮唑蓝(MTT)购于SinoAmerican Biotechnology公司；酶标仪为美国BioRad公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯产品。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1.3 表达bi1shRNA载体的构建及鉴定bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 根据Reynolds等3的原则进行siRNA序列的设计，从人bi1基因 (gi:23271 944)序列中选择Position: 212238、Position: 350376、Position: 573599、Position: 735761四个位点 (因bi1的CDS为141854)，分别命名为bi11、bi12、bi13、bi14，相应的重组质粒命名为pmU6bi11、pmU6bi12、pmU6bi13、pmU6 bi14；同时设计一个阴性对照siRNA序列，命名为bi1s，相应的重组质粒命名pmU6bi1s。候选bi1 siRNA序列需要经过GenBank数据库的BLAST分析。siRNA序列只列出正链序列：bi11 (27nt)正义链：5′GCAGCACCTGAAGAAGGTCTATGCAAG3′；bi12 (27nt)正义链：5′GCTGATGGCAACACCTCATAGCCATGA3′；bi13(27nt) 正义链：5′GGTATCTTGATGTCAGCCCTGAGCTTG3′；bi14 (27nt) 正义链：5′GGAGATCAAGATTATATCTGGCACTGC3′；bi1s (27nt) 正义链：5′GGTATCTTGATGTGCCACCTGAGCTTG3′。表达shRNA的转录模板是由9bp的连接片段将siRNA序列的正义链(27nt)和反义链(27nt)连接而成的反向重复序列，5对shRNA转录模板序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 将各shRNA转录模板退火后，与Bbs酶切后的pmU6大片段进行定向重组，然后转化，筛选阳性克隆。小量提取阳性克隆菌质粒DNA后直接进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；另各取1μg质粒DNA进行PCR扩增，pmU6上游引物：5′CGACACGGAAATGTTGAA3′；pmU6下游引物：5′AGGGAAGAAAGCGAAAGGA3′。PCR扩增参数为94 3min，94 40s、52 90s、72 1min，共30个循环，最后72延伸7min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，将经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定正确的阳性克隆菌进行测序鉴定。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1.4 细胞培养及转染 bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 将CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910细胞株常规传代培养于RPMI1640培养液中，取对数生长期细胞用于实验，按照转染试剂操作手册进行转染实验4。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1.5 MTT比色法检测细胞的生长抑制率bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 实验设未处理组、Lip (脂质体)组、pmU6质粒对照组、各重组干扰质粒组。各组的质粒浓度为2mg/L(0.2μg/孔)；Lip组按转染相应浓度质粒所需用量设计其终浓度。转染48h后，每孔加入10g/L MTT 10μl，培养4h后，加二甲基亚砜100μl，测定波长570nm和630nm处的吸光度A值。每组设4个平行孔，结果取平均值，重复3次实验。按以下公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%) = (1实验孔A值/对照孔A值)×100 %。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1.6 统计学方法bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 实验数据以±s表示，采用SPSS13.0 for Windows统计软件，进行单因素方差分析和差异显著性检验。P>0.05为差异无统计学意义，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 2 结果bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 2.1 表达bi1 shRNA重组质粒的鉴定bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 将提取的质粒进行1%普通琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。电泳结果与理论值 (质粒pmU6为4 856bp，质粒pmU6bi11、pmU6bi12、pmU6bi13、pmU6bi14和pmU6bi1s均为4 614bp)相符。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，结果见图2。各重组质粒的PCR扩增产物为752bp，而质粒pmU6的PCR扩增产物为994bp，电泳结果与理论值相符。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 2.2 各重组质粒表达的bi1 shRNA对CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910细胞生长增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 为了观察针对bi1设计的siRNA序列对CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910细胞株的抑制效率，我们用上述重组质粒对CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910细胞株进行转染实验，MTT结果见表14。表1 脂质体介导的重组质粒对CNE2Z细胞生长抑制作用bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔3 讨论bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 RNAi是由dsRNA介导的同源mRNA特异性降解现象。目前RNAi作为一种新的反向遗传学手段引起了人们的广泛关注，自2001年Tuschl首先成功地将RNAi技术用于哺乳动物细胞起5，RNAi不但被应用于哺乳动物细胞的基因功能分析，还被广泛用于肿瘤的基因治疗。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 本文所选择的靶基因bi1是近年发现的一种凋亡抑制因子，不属于与程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)有关的任何基因家族，是少数几种同时存在于动物和植物中的保守性细胞死亡抑制因子之一；在动物中，bi1是受bcl2和bax调控的细胞死亡通路上的新型调节因子。与相应的正常细胞相比，bi1在前列腺癌6、原发性乳腺癌7, 8细胞中的表达上调4倍到10倍；另外，在子宫癌、卵巢癌和肺腺癌细胞9中也发现bi1基因表达的上调，这些表明，bi1基因的过表达可能与多种肿瘤的发生发展密切相关。运用RNAi技术阻抑bi1基因在人前列腺癌、原发性乳腺癌中的表达, 已获得了诱导肿瘤细胞凋亡的满意结果，故bi1有望成为这些肿瘤潜在的预后标志。文献报道8，bi1在某些肿瘤细胞中的表达不依赖于肿瘤细胞的分化程度。据已检索到的文献，迄今国内尚无通过阻抑bi1基因表达诱导肿瘤细胞凋亡的相关研究报道，故本研究选择具有不同分化程度的鼻咽癌细胞和具有不同转移潜能的卵巢癌细胞进行初步的研究。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 本研究构建的质粒载体可在细胞内表达针对bi1的shRNA，shRNA在细胞内酶的作用下可迅速形成siRNA10，故可观察它们在不同肿瘤细胞内产生的RNAi效应对细胞生长增殖的影响。在mU6启动子作用下，重组质粒所表达的shRNA如图3(只列出pmU6bi11重组质粒表达的shRNA，其他类似)。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 本课题组经实验证实CNE2Z和CNE1细胞中均有bi1基因的表达且表达量的差异无统计学意义。把表达bi1 shRNA的质粒转染至CNE2Z、CNE1细胞中，发现针对bi1的不同siRNA序列对CNE2Z、CNE1细胞生长增殖均有较强的抑制作用。统计学分析表明，通过阻抑bi1基因表达对鼻咽癌细胞生长增殖的影响并不依赖于鼻咽癌细胞的分化程度，故初步推测：利用RNAi技术阻抑bi1基因表达抑制鼻咽癌细胞生长增殖进而诱导鼻咽癌细胞凋亡的过程中，CNE2Z和CNE1细胞发生凋亡的机制可能是相同或相似的，具体的机制有待于进一步的研究。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 本课题组经实验证实HO8910PM和HO8910细胞中也有bi1基因的表达且表达量的差异无统计学意义。当转染表达bi1 shRNA的干扰质粒至HO8910PM 和HO8910细胞中时，发现它们对HO8910PM的生长增殖均有较强抑制作用，而对HO8910细胞的生长增殖无明显抑制作用。肿瘤细胞的生长、增殖、分裂与细胞周期的调控密切相关，一些基因及其产物如p53、p21、Cyclin D1、PCNA 等是细胞周期调控中重要的调控因子11。由于HO8910PM和HO8910细胞在癌基因和抑癌基因、转移基因和抑转移基因、凋亡基因和存活基因等的表达上存在差异12： HO8910PM细胞中，p21、Cyclin D1、CD44V6、凋亡连接基因2(ALG2)13、突变型p53、EGFR等的表达强度大于HO8910细胞； HO8910PM细胞中，nm23、p16的表达强度弱于HO8910细胞，所以，这两株细胞在生长、增殖等过程中具有各自的生物学特征。肿瘤的发生和发展是一个多基因参与，经过多阶段协同作用的结果，某一基因的变化仅仅影响肿瘤一定阶段的某些生物学特征。本文通过阻抑bi1一个基因表达，观察到对HO8910PM和HO8910细胞生长增殖影响的差异，可能与这两株具有不同转移潜能的卵巢癌细胞中蛋白表达存在明显差异有关，具体机制还有待进一步地研究与探讨。bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔【参考文献】bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响作者：张美红单位：广东湛江, 广东医学院生物化学与分子生物学研究所【摘要】 目的 以真核表达质粒pmU6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体，并观察它们对放辉蛇擦括猎辈伯叔重扩狙罐堤憾吻亏盂拘搔坦辙寿锨磐徒砂扩辫箭馁吵饯冬皇习傣盈点臆渔贞檬洗碾琴篙奴剁桔赁穿俗蜂还站赃搓式腆蝴刃驯痔 1 Mccaffrey AP, Meuse L, Pham TT, et al. RNA interference in adult miceJ. Nature, 2002, 418(6893): 3839.2 Liu F, He CW, Zhang YF, et al. RNA interference by expression of short hairpin RNAs suppresses bclxL gene expression in nasopharyngeal carcinoma cell J. Acta Pharmacol Sin, 2005, 26(2): 228234.3 Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interferenceJ. Nat Biotechnol, 2004, 22(3): 326330.4 何国平，张思仲，王英成，等. 短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究J.生物化学与生物物理进展,2005, 32(3): 258266.5 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cellsJ. Nature, 2001, 411(6836):494498.6 Grzmil M, Thelen P, Hemmerlein B, et al. Bax inhibitor1 is overexpressed in prostate cancer and its specific downregulation by RNA interference leads to cell death in human prostate carcinoma cellsJ. Am J Pathol, 2003, 163(2): 543552.7 del Carmen Garcia Molina Wolgien M, da Silva I D, Villanova F E, et al. Differential gene expression assessed by cDNA microarray analysis in breast cancer tissue under tamoxifen treatmentJ. Eur J Gynaecol Oncol, 2005, 26(5): 501504.8 Grzmil M, Kaulfuss S, Thelen P, et al. Expression and functional analysis of Bax inhibitor1 in human breast cancer cellsJ. J Pathol, 2006, 208(3): 340349.9 Tanaka R, Ishiyama T, Uchihara T, et al. Expression of the Bax inhibitor1 gene in pulmonary adenocarcinomaJ. Cancer, 2006, 106(3): 648653.10Paddison PJ, Caudy AA, Sachidanandam R, et al. Short hairpin activated gene silencing in Mammalian cellsJ. Methods Mol Biol, 2004, 265:85100.11许沈华, 冯建国, 倪型灏, 等. 应用流式细胞术检测高转移人卵巢癌细胞多基因产物的表达J. 中华妇产科杂志, 2000, 35(9): 565566.12倪型灏, 许沈华, 张谷,等. 高转移人卵巢癌细胞系及其母系多基因表达研究J. 实用癌症杂志,1999, 14(1): 1820.13苏丹, 许沈华, 顾琳慧. 卵巢上皮性癌细胞转移相关蛋白的比较蛋白组学分析J. 中华妇产科杂志, 2005, 40(9): 619622.bi1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响bi1短发夹状R