生物化学11.第十一章 DNA的生物合成.doc

幻灯片1第十一章 DNA的生物合成 (复制)(DNA Biosynthesis，Replication) 复制是指以亲代DNA为模板合成子链DNA的过程。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+亲代DNA 复制叉子代DNA 幻灯片2第一节 复制基本规律与体系(Basic Rules and System of DNA Replication )一、复制的基本规律复制的方式半保留复制固定起始点双向复制半不连续复制复制的高保真性基本规律(一)半保留复制1.概念 DNA合成时，以亲代DNA解开的两股单链为模板，按碱基配对规律，合成子代DNA的过程。子代DNA，一股单链来源于亲代，另一股单链为新合成。子代和亲代的DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。幻灯片32.半保留复制的实验依据和意义(1)密度梯度实验 梯度离心结果含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液 第一代继续培养于普通培养液 第二代 实验结果支持半保留复制的设想。幻灯片4(2)子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式 (混合式) 半保留式(3)半保留复制的意义按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。幻灯片5(二)固定起始点 复制是从具有特异碱基序列的复制起始点开始。原核生物(一个起始点)，真核生物(多个起始点)。(三)双向复制1.原核生物复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 复制中的放射自显影示意图oriterA B Cl 环状双链DNA及l 复制起始点l B. 复制中的两个复制叉l C. 复制接近终止点幻灯片62.真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。复制子是独立完成复制的功能单位。 53oriorioriori535533553复制子3幻灯片7(四)复制的半不连续性 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。3535解链方向35335 顺解链方向生成的子链，复制为连续进行，称为领头链。领头链(leading strand)随从链(lagging strand) 另一股链复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，称为随从链。 复制中不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 幻灯片8(五)复制的高保真性1.DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读DNA-pol外切活性聚合活性AGA:CGB:5/3/5/3/无活性A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。幻灯片92.复制保真性的碱基选择a) DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价键(磷酸二酯键) 的有序形成。b) 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 NN9R-PNHHNN6反式NN9P-RNHHNN6顺式3.DNA复制保真性依赖三种机制 a) 遵守严格的碱基配对规律。b) 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能。c) 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。幻灯片10二、DNA复制的体系 (一) 底物(substrate) dATP, dGTP, dCTP, dTTP。(二) 模板(template) 解开成单链的DNA母链。(三) 引物(primer) 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合的RNA(DNA)片断。(四) 酶和蛋白因子1.DNA聚合酶 全称为依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)，简称DNA-pol。幻灯片11(1)活性：53 的聚合活性；3 5外切酶活性能辨认错配的碱基对，并将其水解； 5 3外切酶活性能切除突变的 DNA片段。5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5?幻灯片12(2)原核生物的DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 大肠杆菌E.coli中的三种DNA聚合酶分类DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III分子量(KD)109120900聚合速率(核苷酸/分)1 00060 0005 3聚合酶活性+3 5外切酶活性+5 3外切酶活性+生物学功能切除引物延长冈崎片段DNA损伤修复延长子链校读作用校读作用DNA损伤修复幻灯片13DNA-pol(109kD) 功能:对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。N 端C 端DNA-pol 木瓜蛋白酶小片段大片段/Klenow 片段 DNA聚合酶活性 ， 3 5 核酸外切酶活性5 3核酸外切酶活性Klenow片段是实验室合成DNA的常用工具酶。 幻灯片14DNA-pol (120kD) DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。 DNA-pol (250kD) 功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 幻灯片15(3)真核生物的DNA聚合酶填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制起始引发，引物酶活性功能+-35高高高？中53聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）DNA-pol填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制起始引发，引物酶活性+-35外切酶活性高高高？中53聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）DNA-pol参与损伤与修复生物学幻灯片162.其他酶与蛋白因子(1)解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，打开氢键，使DNA双链解开成为两条单链。(2)引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶。(3)单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。 稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白因子通用名功能幻灯片17(4)DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 指理顺DNA链，改变超螺旋状态的酶，分为I型和II型。 拓扑异构酶 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。 拓扑异构酶 切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。10 8 局部解链后幻灯片18(5)DNA连接酶(DNA ligase) 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。3HO5335DNA连接酶ATPADP535幻灯片19第二节 DNA复制的过程(The Process of DNA Replication)一、原核生物的DNA生物合成 (一)复制的起始DNA解开成单链，提供模板。需要解决两个问题合成引物，提供3-OH末端。幻灯片201. DNA解链的起始点 GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-ACACATATT-TTTGGATAA-ACACCTATT58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列5353E.coli复制起始点 oriC幻灯片212. 引发体和引物 Dna B、 Dna C3 Dna A引物酶53DNA拓扑异构酶SSB5含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 幻灯片223引物酶3 HO5引物535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。 幻灯片23(二)复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 3DNA-pol53OH 3dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP幻灯片241.领头链的延长领头链的合成领头链沿着5/ 3/方向可以连续的延长。幻灯片252.随从链的延长幻灯片26复制简图幻灯片27复 制 延 长 动 画幻灯片28(三)复制的终止 1.原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 ori terSV40500oriter E.coli8232幻灯片292.随从链上不连续性片段的连接555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA连接酶幻灯片30二、真核生物的DNA生物合成 真核生物 DNA 复制在细胞周期的S期进行，也可分为起始、延长和终止三个阶段，每个阶段的基本过程与原核生物DNA复制相似，但存在不少差异。 哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM幻灯片31(一)复制的起始 1.真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 2.复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 3.增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。 幻灯片32(二)复制的延长 真核生物的聚合酶催化子链的延长，并有校正功能。引物和冈崎片段 (约200bp) 都比较短。 3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体幻灯片33(三)复制的终止1.染色体DNA呈线状，复制在末端停止。2.复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。3.染色体两端DNA子链上复制的RNA引物，去除后留下空隙。53355335+5333355幻灯片34(四)端粒与端粒酶1. 端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。2. 结构特点由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端序列是多重复富含G、C的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG3.功能维持染色体的稳定性。维持DNA复制的完整性。端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associatedprotein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 4. 端粒酶(telomerase)幻灯片355.端粒酶催化作用的爬行模型 真核DNA复制后，两个5末端的引物被切除，缺口无法填补，故DNA将面临多次复制而逐渐缩短的问题。 幻灯片36第三节 DNA损伤与修复(DNA Damage and Repair)突变(Mutation)是指DNA分子中碱基序列的改变，又称为DNA损伤(DNA damage)。突变是进化、分化的分子基础突变导致基因型改变突变导致死亡突变是某些疾病的发病基础意义幻灯片37一、引发突变的因素(一)自发因素复制过程中发生的突变，可发生10-16频率的突变。 (二)诱发因素1.物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射PRRNNHOOCH3NNHOOCH3PRRNNHOOCH3NNHOOCH3UV嘧啶二聚体幻灯片382. 化学因素常见的化学诱变剂化合物类别作用点分子改变碱基类似物如：5-FUA 5-FU G-A -T -G -C -羟胺类（NH2OH）T C-T -A -C -G -亚硝酸盐（NO2）C U-G -C -A -T -烷化剂如：氮芥类G mGG mGDNA缺失G3. 生物因素如逆转录病毒等。幻灯片39错配缺失 插入 重排框移(三)突变的类型1.错配 (mismatch)DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。(1) 转换:发生在同型碱基之间，即嘌呤代替 另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 (2) 颠换:发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧 啶或嘧啶变嘌呤。2.重排(rearrangement)DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。 幻灯片403.缺失(deletion)、插入(insertion)和框移(frame-shift) (1)缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。(2)插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。(3