发现新药的有效方法—反向内分泌学.docx

发现新药的有效方法反向内分泌学:国外医药合成药生化药制剂分册2001,22(2) 发现新药呐有效方法一反向内穷泌学 圜 湖北医药工业研究院李颖编译陈本川审校 统内分泌学是通过纯化,确定其化学和生理学性 质来鉴别激素,再利用放射性配体研究配体与受 体的相互作用鉴别其特异性受体,最后描述基因及其染 色体的定位.而反向内分泌学是先采用分子生物学的方 法鉴别罕见受体(0rpha盯receptor,为目前尚未找到配体 的受体),再确定其特异性配体.新合成的配体可在报道 基因(reportergene,为处于另一基因下游并可反映转录 及上游基因表达水平的基因)嫩活试验中进行测试,筛选 出选择性配体,并有望成为内分泌及其相关疾病的新治 疗药物. 1鉴定新的罕见受体及其配体 检出和最终鉴定新的罕见受体的策略是基于其信使 核糖核酸(mRNAs)能对标记的寡核苷酸进行杂交,此寡 核苷酸代表同一受体超家族不同成员的共同规范序列. 表达人维A酸受体(hRAR)这一孤独受体的克隆最初 是用一个含24个核苷酸的探针进行杂交,该探针设计成 甾体-甲状腺激素受体超家族DNA结合域(C区)的连续 序列.此方法的难点是受体在培养细胞中表达后,靶基 因转录激活候选配体的鉴定.而维A酸受体(RARs)利 用该方法的主要问题在于尚不清楚其启动子能否用于报 道基因构建的靶基因.通过构建工程化的嵌合式受体构 建物解决了这一难题,像人雌激素受体(hER)最初的情 况一样.当时将hERDNA结合域(DBD)中的66.氨基酸 C区置换成人糖皮质激素受体(hGR)的C区,产生一个 含有GRDBD的嵌合式雌激素受体忸R),形成”弹夹” (ER.GRCAS).当舍有糖皮质激素效应元件(GRE)的 报道基因构建物在靶细胞共表达时,用嵌合构建物即能 测出对构建ER的GRE的雌激素效应嵌合式受体提供 了鉴别RARs核受体的关键方法,ER的DBD插入候选 的罕见受体hRAR口,取代该受体DBD的序,产生 hRAR-ER0.在裂解的以hRARcDNA转染的 HeLa细胞进行竞争性结合试验,确定了维A酸存在核 受体hRAR口 2选择性配体用于治疗内分泌及相关疾病 2.1抗乳腺癌的化学保护剂RXR配体targmtin 合成的rexinoid受体(RXR)选择性配体targretin (1),亦称LGD-1069,能与3种rexinoid受体(,.T) 紧密结合,但对RAR2的亲台力很弱,不能反式激活 (transact-kate)维A酸效应基因.试验表明,1能预防大 鼠由亚硝基甲基脲(NMU)诱导的乳腺癌的发生,但没有 其它类维A酸典型的毒性,如高甘油三酯血症,粘膜与 皮肤毒性和头痛等.l降低肿瘤发生率的作用与他莫昔 芬(tamoxifen)相似.l不影响雌激素,黄体酮或催乳素的 水平,但能抑制由雌激素和他莫昔芬引起的子宫增生. l抑制NMU诱导肿瘤的作用机理可能是直接活化 RXR特的内源性类维A酸.1 能使72%由NMu诱导的大鼠原发性肿瘤完全退化,而他 莫昔芬最高剂量组不能完全抑制1/3的肿瘤生长,中等 剂量l(1Omg,kg)与低剂量他莫昔J:(150ug/)台用,能 使26%的肿籀退化.此结果表明,与同等剂量的他莫昔 芬(5.6%)和l(10.5%)单用的疗效相比,台并用药有协 同作用 tarlaUa(1) 2.2抗胆固醇和抗糖尿病的PPARg.PPAR,配体 过氧化物酶体增殖体激活受体(PPARs)主要参与能 量平衡的调节,PPAR在肝,肾,心脏和皮肤中表达, 鑫i豁 WWW.pharmagate.corn PPARr多数在脂肪细胞,大肠和单核细胞中表达,而是动脉粥样硬化形成的重要调节剂. PPAR/3以普遍存在的模式进行表达亚油酸,亚麻酸ox.LDL的2个氧化脂肪酸成分:9-羟基十八碳二烯 和二十碳五烯酸是这一族受体的泛激动剂,但选择性台酸(9-HODE)和13-羟基十八碳二烯酸(13-HODE)是PPARr 成配体是重要的前药.且某些配体已作为药物使用内源性强配体和活化剂.在致动脉硬化效应的信号途径 PPAR的配体fibrates(2),降低血甘油三酯有很强的作中具有十分重要的作用所形成的回路由OX.LDLs 用.2与PPAR的结合能调节甘油三酯及其代谢物脂质动,然后通过CD36细胞表面受体内化一旦内化后, 蛋白释放脂肪酸.啮齿类动物体内因缺._PPAR.故而ox-LDLs从其失活的胆固醇酯中释放出9-HODE和13. 甘油三酯和胆固醇的异常代谢导致肥胖症.HODE以激活PPARr,接着.PPARr增加Tox.LJ踅 PPARr罕见受体是抗糖尿病药物噻唑烷二酮启动的cD36细胞表面受体的转录.这一恶性循环过程 (thiazolidinediones,TZDs)的分子作用靶位.其中曲格至少部分与动脉粥样硬化的形成有关,因为此过程与巨 列酮(troglitazone,3)已在临床中使用,3能降低血液中噬细胞的分化是同时发生的,单核细胞在循环过程中也 的葡萄糖水平和减少循环中的脂肪酸此受体也在脂肪起着重要的作用.ox-LDL的摄取过程至少有两方面的重 细胞中高度表达-这与脂肪细胞特有的分化作用有关,要作用:其一是诱导巨噬细胞中的单核细胞分化:其二 而脂肪细胞的分化与控制血液中葡萄糖的水平密切相关.是诱导细胞表面清除受体CD36的合成.这两种作用显 . 一然是9-HODE和13-HODEYPPARr激活的结果 o Yo4RZR/ROR配体作为抗关节炎药物 “ R/大鼠佐剂关节炎模型类似于类风湿性关节炎的慢性 flbrne(2)曲格列酮3)细胞依赖性自身免疫性疾病.利用这个模型已鉴别出 2.3抑制动脉粥样硬化的调节#1PPARr配体一类TDzs化台物可作为高效抗炎药物和关节损伤抑制 动脉粥样硬化的形成是由于动脉壁被脂肪斑痕形成剂.CGP-52608(4)是此类TDZs的先导化台物,在浓度 的早期损伤所覆盖,这些斑痕由充满胆固醇的巨噬细胞低至O. 01mg,kg时仍具有抗关节炎的作用4有特异性的 或所谓的”泡沫细胞”组成.”清除受体”负责摄取富结合力 ,能激活罕见受体类维A酸z受体/类维A酸受体相 含胆回醇的低密度脂蛋白(LDLs).而LDLs只有经一系 关的罕见受体(RZR/ROR);褪黑激素(meIatonin) 学竺竺竺,的:.LD才会被是该受体的内源性配体.此2种不同结构的11)z.:摄取.这些修饰可在各种动脉细胞如内皮细胞,平滑肌.一一 细胞或巨噬细胞中进行.脂肪斑痕的形成部分起因于单BRL-49653(5)和4,能分别特异性地激活PPARr和 核细胞对0x.LDL的募集作用和0x.u)L减少停留的巨噬RZR/RORa.5能特异性抑制分化的脂肪细胞leplin的 细胞的移动能力.产生?抵销抗胰岛素大鼠体重减轻并降低血中葡萄糖和 PPARr与脂肪细胞的分化有关,并且控制细胞对脂甘油三酯水平?而4对大鼠佐剂抗关节炎模型显示出较 质的摄取,rtPPART在动脉粥样硬化损伤的泡沫细胞中 高度表达.此外单核细胞与ox-LDL触也能诱导Ptr 的表达.ox-LD【墒过增加细胞表面清除受体CD36的转 录-促使自身的摄取.这些研究结果提示,PPARr配体 曲格列酮因可能引起严重的肝脏毒性而撒出 强的抗关节炎作用.这两种化合物可作为非胰学上的LXR配体.缺乏 _LxR的小鼠在其肝脏中累积了过量的胆固醇酯,当给 予高胆固醇食物时,最终会导致肝功能的损伤.LXR与 RXR形成杂二聚体并在与配体结合时与该基因启动子的 生物异源物质效应元件(xRE)相互作用,诱导关键的药 物代谢酶CYP3A4的转录. 3.2孕甾烷X受体 孕甾烷x受体(PXR)的配体与刺激CYP3A4基因转 录的物质是同一种药物.PXR主要在肝肠中表达,在控 制报道基因的cYP3Al上共转染的有XRE及PXR报道 基因构建物激活的基础上,可预测药物的相互作用.天 然的PXR内源性配体是孕甾烷类,其中有孕酮代谢产物 5B.孕甾烷.3,20-酮. 33组成型雄甾烷受体 组成型雄甾烷受体(o在肝组织中有较高的表达, 能调节甾体羟化酶CYP2B基因的转录.在已知配体不存 在时它以高组成型转录活性与睾酮代谢物结合而显示抑 制作用.这一抑制活性可能是雄甾烷对细胞产生的未知 内源性配体的拮抗作用.这种激素结合也引起CAR激 活蛋白复台物的解离. 3.4法呢酸类(famesoid)X受体 法呢酸类x受体(FXR)在大鼠中受甲羟戊二酸途径 的15个碳原子产物法昵醇微弱活化,而该途径承担着甾 体和类聚异戊二烯的生物合成.但小鼠或人的同源受体 都不能被法呢醇激活.该罕见受体的天然配体具有鹅脱 氧胆酸的特征,能调节并保持胆酸体内稳态有关的某些 基因,故可能具有胆酸核受体的功能. _r丽_趸 本文论述反向内分泌学对于新药开发的重要性.某 些合成配体,如Pr的选择性配体具有抗糖屎病作 用,如曲格列酮.RXR选择性配体l和PPARr选择性 配体4有望用于控制危及生命的疾病和阻止乳腺癌和关 节炎等的蔓延脂肪酸衍生物9-HODE和13一HODE是 PPARr的内源r性配体和巨噬细胞分化及单核细胞信息转 导的激活剂,可作为血管疾病的新治疗途径此外,其 它受体如LXR,FXR和CAR的某些配体可用于治疗由 药物代谢缺陷和其它因素引起的疾病. 鬻鬻鬻鬻 (上接第69页) 尽管这些钝化酶在细菌耐药性方面起着一定的作用, 但细菌对这类抗菌药物产生耐药性主要是其作用靶位被 改变或修饰所致.因此,利用这种耐药性机制进行新药 研究的报道并不多见. 4其它钝化酶 细菌对其它某些抗菌药物也可产生各种不同的钝化 酶,其中早期研究得比较多的是氯霉素钝化酶,D.酰基 转移酶(ClAT)该酶在葡萄球菌,链球菌,肺炎球菌, 肠杆菌和奈瑟苗中存在,其编码基因盯_以定位在染色体 上,也可定位在质粒上.最近研究发现,有另外一类 被称之为XATs(xenobioticacyltransferase)的氯霉素酰基 转移酶,该酶除了能够酰化氯霉素外,对具有羟基的