乙肝五项的影响因素与技术分析.doc

河南科技大学本科毕业论文设计河南科技大学高等教育自学考试毕业论文 题 目 ELISA方法检测乙肝五项的结 果影响因素分析 地 市 学 校 商丘市高等医学专科学校 专 业 医学检验 准考证号 140113101163 考生姓名 申蒙蒙 指导教师 二一四年九月八日目 录摘 要11前 言21.1乙肝表面抗原（HBsAg）21.2 乙肝表面抗体（HBsAb）21.3 乙肝抗原（HBeAg）31.4 乙肝E抗体（HBeAb）31.5乙肝核心抗体（HbcAb）42影响因素42.1 样本采集与处理的影响42.2 试剂的影响53 操作技术的影响64 检测结果研读的影响75 HooK效应影响76 干扰物质的影响87 药物的影响88 临床意义8结 论10参 考 文 献11致 谢12摘 要摘要 目的 探讨 ELISA 法检测乙肝两对半常见影响因素和临床意义。了解这些因素会造成的结果，及其处理方法，减少差错事故发生，保证实验结果的准确性。方法 回顾分析 ELISA 法检测乙肝两对半的检验步骤，严格按照试剂盒说明书检测，总结乙肝两对半检测的影响因素, 并对临床意义进行探讨。结果 乙肝检测时，标本处理不合格、试剂影响因素、操作技术失误、检验人员的业务水平、检验过程中的标准操作规程、检验结果的研读等是 ELISA 法检测乙肝乙肝两对半的影响因素, 两对半各项指标对临床诊治乙肝具有指导意义。结论 乙肝两对半是乙肝临床治疗依据的重要指标, ELISA 法是检测乙肝的灵敏方法, 严格按照操作步骤, 排除各种影响因素的干扰，加强质量控制, 乙肝酶法检测时要排除各种影响因素的干扰，尽量杜绝出现假阳性、假阴性结果，确保检测结果的准确性。ELISA 试验以灵敏度较高，特异性较好的特点在临床广泛应用。但操作中的每个环节对试验的检测结果影响较大，如不按常规操作，有时会出现假阳性和假阴性的情况。我们根据多年在检验室的工作经验，总结以下可能会影响乙肝五项 ELISA 检测结果的因素。关键词：乙肝检测；ELISA法；标本；操作；影响因素- 0 -11前 言乙型病毒性肝炎（下称乙肝）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性传染性疾病， 严重危害人们的身体健康。这些肝炎的共同点是可测出 HBV 的血清学标志， 这些标志包括 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb， 也就是俗称的乙肝两对半，乙肝的预防、诊断与疗效等方面很大程度都依赖乙肝两对半的检测1。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测乙肝免疫学标志物的主要方法，具有简便、灵敏、特异性高等优点，成为基层医院对乙肝诊断分型疗效观察的主要手段。 但ELISA 测定中影响因素较多，有时可见到一些假阳性或假阴性。 因此，排除各种影响因素的干扰，有利于提高检测结果的准确性。1.1乙肝表面抗原（HBsAg）HbsAg由 226 个氨基酸组成，由S基因编码，有多种亚型。因最早在澳大利亚发现又称“澳抗”。HbsA g是H BV 感染后第一个出现的血清学标志物，HbsA g（+）表明体内有乙肝感染，但并不反映乙肝病毒有无复制、复制程度、传染性强弱。也有HbsA g（-）的H BV 感染，是由于乙肝病毒的S基因突变或变异1，导致H bsA g氨基酸序列发生改变，而使现行的ELISA 试剂不能检出，要通过HBV -DNA 定量进行确认还有一种情况是虽有乙肝感染，但可能处于窗口期，导致HbsAg不能检出，要通过流行病学调查或进行HBV-DNA 定量等进一步检查才能明确诊断。 1.2 乙肝表面抗体（HBsAb）HBsAb是乙肝病毒的中和抗体，意味着人体对乙肝病毒产生了抵抗力。乙肝感染者出现HBsA b是乙肝痊愈的一个指标，表明病毒已基本清除。接种疫苗和感染乙肝病毒后依靠自身免疫力清除- 2 -乙肝病毒的人也会产生此抗体。临床也会见到HBsAg、HBsAb双阳性的标本，可能是由于不同亚型的乙肝病毒感染。此外也有学者证明乙型肝炎病人HBsAb出现后，血清内仍有DNA复制，随着时间的推移HBV -DNA 的检出率逐渐下降2-3。一般认为抗体的P/N 值（样本血清吸光度值与阴性对照吸光度之比）达到 10 以上时，说明体内已有免疫力可以预防HBV 的感染如P/N值在 10 以下，虽然也是抗-HBs阳性，但其保护力减弱甚至不能预防HBV 感染，此时有必要加强注射乙型肝炎疫苗，使抗-HBs滴度迅速提高，起到保护作用。1.3 乙肝抗原（HBeAg）HbeAg与Dane颗粒在血清中平行出现，与DNA 聚合酶在血循环中消长动态也基本一致，使体内 HBV 复制及血清具有传染性的指标HbeAg持续存在时间一般不超过十周，否则提示感染转为慢性化。H beA g阴转表明病毒复制水平降低，病变趋于静止。但临床上也会遇到HB sA g(+)、HbeA g（-）、HBcA b(+)而HBV -DNA 阳性的病例，因此HBeA g转阴并不意味着病毒的复制停止或减弱，有学者认为此现象有可能为血清转换期或HBV -DNA pre-C 区发生突变有关，动态观察后仍没有改变，则可能为前C 区突变。1.4 乙肝E抗体（HBeAb）HbeAb常出现于HbeAg转阴后。e抗原阴性、e抗体阳性，表明乙肝相对好转，说明病毒复制趋于减少，预示患者的传染性已显著或相对降低，病毒复制趋于减少。持续e抗体阳性，说明乙肝传染性较弱，但并非完全没有传染性。有文献报道，虽然HbeAg（+）阴转为HbeAb（+）但仍有部分患者HBV -DNA 阳性。此现象有可能与HBV -DNA 前C 区发生突变有关，出现“免疫逃逸”或不同亚型的HBV 重叠感染。1.5乙肝核心抗体（HbcAb）HBcAb常紧继HBsAg、HBeAg之后再血清中检出，H bcA b主要分为两类，一类是HBcIgM 另一类是HbcIgG 。早期以IgM 为主，HBcIgM 在肝炎急性期呈高滴度，是判断急性乙肝感染的重要指标，随着急性乙肝的恢复，抗HBcIgM 滴度降低乃至消失，如持续高滴度，常表明有慢性化倾向。在慢性活动性乙肝患者中，抗HBcIgM 检出率及滴度亦较高，说明H BV 复制活跃，是传染性强的指标之一；急性感染恢复期及慢性子持续性感染以HbcAb-IgG 为主。临床上常见单项HbcAb阳性，可见于（1） 既往感染；（2） 低水平携带；（3）核心窗口期血清中HbsAg、HbeAg消失，而HBsAb还未出现；（4）被动获得，如经输血和胎盘获得。因此要通过流行病学调查、其他辅助检查或临床试验等方法才能得出准确的临床诊断。 2影响因素 ELISA法广泛用于乙肝两对半检测。但ELISA测定中影响因素较多，有时可见到一些假阳性或假阴性，医院检验科就ELISA测定乙肝两对半的影响因素及对策做如下讨论：2.1 样本采集与处理的影响标本的影响 标本应避免溶血,红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰与显色剂发生显色反应。血块完全收缩使标本中的非特异性活性物质部分或全部失活, 若在血液还未开始凝固时强行离心分离血清, ELISA 测定过程中可形成肉眼可见的纤维蛋白块, 易造成假阳性结果。2.1.1标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。2.1.2采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。2.1.3标本凝固不全，正常血液采集后1/22h开始凝固，1824h完全血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。2.2 试剂的影响2.2.1 试剂盒的影响 试剂盒的质量是保证实验结果准确性的必要前提, 各厂家的试剂盒灵敏度、特异性、精密度、稳定性和操作简便性有一定的差异。试剂盒保存要求在 2 8 环境,实验时将试剂盒必须放到室温平衡 0. 5 h。2.2.2 检验人员的影响 检验医师应掌握 ELISA 用于乙肝两对半测定的质控方法原理及失控处理原则, 熟悉操作中易出现问题的实验环节, 掌握乙肝两对半各标志物之间存在意义, 正确使用测定仪器及加样器。2.2.3不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。3 操作技术的影响3.1 首先要使用一次性加样吸头，必免污染，另外加样过程中一定要垂直加入准确量的血清，加样要准确。避免出现加错孔或把血清或酶喷溅到反应孔外，造成污染。且勿触碰包被板底部，使抗体（抗原）脱落影响结果。3.2 温浴影响 温浴一般ELISA检测乙肝五项的放置的温度为37，如果温度太高就会使包被物脱落失活，而温度达不到37时，则影响反应速度，从而影响测定结果。3.3 冼涤 是ELISA操作的重要环节，手冼条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。3.4 洗板 通过洗涤分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物, 也可以把非特异性吸附蛋白质、血球、细菌中酶等干扰去掉。每次洗板都应使用新鲜制造的蒸馏水或去离子水稀释洗涤剂, 防止洗涤液受污染影响洗板效果。3.5 显色 显色是 ELISA 法测定乙肝两对半中最后一步温育, 温育使反应孔内的酶标物质辣根酶催化底物生成有色产物。此过程受温度、时间和光线等条件影响, 通常底物显色在37 10 40 min 反应彻底完成, 底物液受光照会自行变色, 显色反应需在避光环境进行。4 检测结果研读的影响4.1 结果判断须在终止液加入后 10 min 内完成, 以免出现孔内结晶, 影响酶标仪的测试。操作者要有高度的责任心, 确保试剂的质量及有效期的同时, 对于复查后的异常结果应重新采集标本再予复查, 在整个实验过程中加入外部质控血清进行严格的质量控制。所有复检要有详细记录。4.2肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。5 HooK效应影响Hook状效应是指抗原过剩致酶联免疫(ELISA)一步法测抗原出现假阴性的现象。在抗原抗体反应时，抗原抗体须在一定比例范围内才能出现最大凝集，当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，抗原过量或抗体过量都会导致两者交联度降低，从而导致凝集程度与实际浓度不符，出现结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性结果。 随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。6 干扰物质的影响 有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用5630分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。7 药物的影响 高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射200mg乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5M的盐酸处理标本1小时可提高出率。8 临床意义8. 1 HbsAg 乙肝病毒表面抗原, 为已经感染病毒的标志, 并不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱。8. 2 HbsAb 乙肝病毒表面抗体, 为中和性抗体标志, 是是否康复或是否有抵抗力的主要标志。乙肝疫苗接种者, 若仅此项阳性, 应视为乙肝疫苗接种后正常现象。8. 3 HbeAg 乙肝病毒 e 抗原, 为病毒复制标志。持续阳性 3个月以上则有慢性化倾向。8. 4 HbeAb 乙肝病毒 e 抗体, 为病毒复制停止标志, 病毒复制减少, 传染性较弱, 但并非完全没有传染性。8. 5 HbcAb 乙肝病毒核心抗体, 为曾经感染过或正在感染者都会出现的标志, 核心抗体 IGM 是新近感染或病毒复制标志, 核心抗体是感染后就会产生的, 对于辅助两对半检查有一定的意义。- 14 -结 论 乙肝是当前严重危害人们身体健康的传染病之一, 血清两对半检测对乙肝的诊断, 病程监测, 疗效观察起到了一定的作用, 常用的检测方法为 ELISA 法。但 ELISA 检测中受到许多因素的影响, 如标本留取与处理、加样、孵育、洗板、显色及结果判读, 如不注意可能导致假阳性或假阴性的结果。具体操作中应严格按照操作步骤进行, 设立阴阳对照及临界值测定, 同时做好室内质控、室间评价, 以严谨的工作作风检测每一份标本, 对有疑义的检验结果要复查, 才能保证检测质量, 杜绝假阳、假阴性结果。 为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。 要避免标本出现严重溶血，血红蛋白中含有血红素基团,其有类似过氧化物的活性。 因此在以 HRP 为标记酶的 ELISA测定中, 如果血清标本中血红蛋白浓度过高, 就很容易在温育过程中吸附于 ELISA 包被孔中不易洗去, 从而造成结果异常。 为此标本采集和进一步处理时要避免出现溶血。 标本的保存时间不宜过长如果标本在冰箱中放置时间过长, 第一可能因为标本在采集和处理中细菌污染导致结果异常, 原因有二:细菌在生长过程中分泌的一些酶类物质可能会对抗原抗体或 HRP 蛋白产生分解作用, 而影响结果;某些细菌的内源性酶如果洗涤不彻底本身会对测定产生非特异性干扰。 第二长时间放置可使得检测的抗原或抗体免疫活性减弱,可出现假阴性。 为克服以上干扰, ELISA 测定的血清宜新鲜采集;如果不能立即测定, 建议血清标本在无菌操作下分离, 可在2 8下保存1周。如不是无菌操作建议冰冻保存, 样品长时间保存, 应存于-70以下。血清不能用 NaN3因为 NaN3 可抑制一步法 ELISA 测定系统中 HRP 酶的活性, 属于酶抑制剂。 总之，乙肝两对半检测必须排除各种影响因素的干扰才能为临床提供正确可靠的检测结果。参 考 文 献1 蒋福国 薛海斌 乙肝五项酶联免疫吸附法检测结果常见影响因素分析J. 中国煤炭工业医学杂志, 2007, 10(9):10572 臧勇 酶联免疫吸附法检测乙肝五项结果常见影响因素分析J 中国实用医药 2010,