质粒DNA的复制.doc

质粒上的复制子具有方向性吗？我欲将一质粒上的复制子亚克隆至另一质粒,但由于酶切位点限制,只能用单酶切,这样就存在正、反连接的问题，请教各位同道，复制子的方向性对质粒的复制有影响吗？谢谢！ 基因组能独立进行复制的单位称为复制子（ replicon ）。 每个复制子都含有控复制起始的的起点 （ origin ） 和终止复制的终点 （ terminus ）。 起点和终点均为一段核苷酸序列。 复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，它就进行下去，直到整个复制子完成复制。 复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。 同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒的不相容性(plasmid incompatibility)，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。质粒的不相容性是质粒分类的重要标志。有人曾用E. coli作过一个关于“质粒不相容性与拷贝数的关系”的实验。从实验我们知道质粒不相容的现象与质粒拷贝数及分离调控有关。一个相容群(Compatibilitygroup) 定义为一组在同种细菌细胞内不能共存的质粒,它们不相容的原因是它们在一些对质粒存在很重要的过程中不能彼此区分,而DNA 的复制和分离就是这种过程。质粒不相容性的负控制(Negative control) 模型符合这样的观点，即拷贝数控制是通过合成衡量原点浓度的抑制物完成的(这与调控细菌染色体复制的滴定模型相同)。 我们可用同一相容群中另一种质粒的形式引入新原点模拟原有质粒的复制，这时存在两个原点，所以进一步的复制被抑制，直到两个质粒被分配到不同的细胞中，形成正确的复制前拷贝数。 如果负责将产物分配到子细胞中的系统不能识别两个质粒则会出现相似的效应。例如，如果两个质粒有相同的顺式作用分离位点，它们之间的竞争就会保证将它们分离到不同的细胞中，在相同的品系中不能存活。从它们的目的来说质粒是自私的。进入细菌后，驻留的质粒阻止其它相同的质粒进入。质粒不相容性(Incompatibility) 是建立这些区域性权利的主要手段。一个相容群中一个成员的存在不能直接影响属于另一群的质粒存活。给定的相容群(带有单拷贝质粒)中只有一个复制子能留在细菌中，但不与其它相容群中的复制子相互作用(尽管在有限的条件下，它们能竞争lebensraum)。第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制一质粒DNA复制的多样性不同质粒DNA的复制在如下几个方面存多样性：（i）对寄生酶的依赖性 （ii）DNA聚合酶的利用 （iii）复制的方向性 （iv）复制的终止（v）复制型 二ColE1质粒DNA复制的启动ColE1质粒DNA的复制，是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNA两种RNA分子，都是由ColE1 DNA转录产生的。其中RNA也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切割，从而释放出3-OH末端，作为供DNA聚合酶合成DNA的引物。RNA可以通过同RNA结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。因此，从本质上讲，ColE1质粒的复制启动显然是受一种负反馈机理控制的。根据这种模型，细胞中RNA分子的浓度是随着质粒拷贝数的多寡而增减的。例如，若细胞中质粒拷贝数下降到正常数值以下的水平，RNA的浓度也就相应降低，于是质粒的复制也就受到较少的抑制，结果导致其拷贝数的上升。三质粒复制控制的分子模型目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种：其一是自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model），其二是抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model）。前者的核心内容是，阻遏蛋白质的合成受负反馈（negative feedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。后者的关键论点是，阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。（1）抑制蛋白质稀释模型抑制蛋白质稀释模型如图4-7所示。它认为质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径：一种是通过同质粒DNA的复制起点（oir）结合，直接地抑制质粒DNA的复制；另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。（2）自体阻遏蛋白质模型在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后，L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋白质模型（图4-8）。这个模型对质粒DNA复制控制机理有两种解释：1.质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的。Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启劝子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合