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核酶和反义寡聚核苷酸在临床上的应用 核酶 核酶 ribozyme 是一种具有核酸内切酶活性的反义rna分子 可特异性地切割靶rna序列 具有解离后重复切割相同靶分子的能力 核酶 核酶的发现核酶的类型核酶的应用 核酶的发现 简史发现过程发现意义 thomasr cech 切赫 t r cech 1947 美国人 因发现rna的生物催化作用而与奥尔特曼共同获得1989年诺贝尔化学奖 他独立地发现核糖核酸 rna 不仅像过去所设想的那样仅被动地传递遗传信息 还起酶的作用 能催化细胞内的为生命所必需的化学反应 在他们的发现之前 人们认为只有蛋白质才能起酶的作用 他最先证明rna分子能催化化学反应 并于1982年公布其研究结果 1983年证实rna的这种酶活动 sidneyaltman 奥尔特曼 s altman 1939 美国人 因发现rna的生物催化作用而获奖 1978年和1981年奥尔特曼与切赫分别发现了核糖核酸 rna 自身具有的生物催化作用 这项研究不仅为探索rna的复制能力提供了线索 而且说明了最早的生命物质是同时具有生物催化功能和遗传功能的rna 打破了蛋白质是生物起源的定论 简史 传统概念中酶都是蛋白质 因此 当1968年franciscrick在他的论文 基因密码的起源 一文中提到 可能第一个酶是具有复制能力的rna 时 没有人予以注意 20年后 在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上alanweiner做会议总结时又重复了20年前franciscrick的话 会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的rna分子上 1989年诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活性的rna分子的美国科罗拉多大学 coloradouniversity 的thomasr cech和耶鲁大学 yaleuniversity 的sidneyaltman 核酶的发现 t cech的工作 t cech的重要发现开始于1982年研究目的 细胞中dna转录成rrna后 rrna中一些无意义的序列 或 内含子 intron 如何从rna分子中剪切下来的 根据过去传统的概念 这一过程必须要有蛋白质酶来完成 t cech的工作 研究对象 原生动物四膜虫 tetrahymenathermophila 含有一种rna 其组成中除了核糖体rna外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列 interveningsequenc ivs 研究发现 转录产物rrna前体很不稳定 在鸟苷和mg2 存在下切除自身的413个核苷酸的内含子 ivs 使两个外显子拼接起来 变成成熟的rrna分子 催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的 称为自我剪接 cech的实验结论 ivs具有类似蛋白酶的功能 能够打断及重建磷酸二脂键 相信rrna前体能靠自己完成剪接过程 在一定条件下rrna前体可以按一定方式盘绕 进而自己切割自己 以后再把保留rrna部分的末端连接起来 即它是可以催化自由底物的具有酶活性的rna rna分子具有自身断裂的催化作用 以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应 s altman的研究工作 研究目的 t rna分子的剪接过程研究发现 在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下 核酸酶p ribonucleasep rnasep 中的rna能够切割trna前体的5 端 s altman的实验结论 过去都认为核酸酶p的催化作用由rna和蛋白质共同完成的 而该实验证明 核酸酶p的催化作用是由rna完成的 而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用 由于这类酶具有类似核糖核酸酶功能 而化学本质为核酸 因此被切赫称之为核酶 核酶发现的意义 1 它突破了 酶是蛋白质 的传统概念 自从60多年前j summer首先结晶了脲素酶 urease 并证明这个结晶蛋白能催化脲素水解以来 很多酶被纯化 而且都是蛋白质 从而酶被定义为 生物催化剂是一种称作酶的特殊蛋白 使代谢进程加速的生物催化剂 核酸性酶的发现无疑是对传统的酶和催化理论巨大的冲击 核酶发现的意义 2 核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的起源这一问题有了新的认识 对生物前化学 prebioticchemistry 有重要贡献 长期以来对生命起源中是先有蛋白质还是先有核酸争论不休 核酸分子含有合成蛋白质的氨基酸序列的信息 而蛋白质 酶 又是在核酸修复 转录 剪接 翻译等等所有环节中必须存在的 因此谁先谁后的问题就像 鸡与鸡蛋 的问题一样令人困惑 长期以来 人们认为所有的生命形式在冗长的相互依赖的循环中 信息分子和功能分子是分离的 核酸是信息分子 而蛋白质是功能分子 核酸性酶的发现给人们以启示 即rna分子不但有复制的功能 含有复制的信息 而且还有催化的功能 因此既是信息分子 又是功能分子 这些新的概念无疑将对生物前化学的研究开辟新的思路 核酶的类型 剪切型核酶 这类核酶催化自身或者异体rna的切割 相当于核酸内切酶 剪接型核酶 这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性 核酶的酶活性种类 核苷酸转移作用磷酸二酯键水解作用磷酸转移反应催化作用脱磷酸作用限制性内切酶作用 剪切型核酶 锤头型核酶发夹型核酶丁型肝炎病毒 hdv 核酶蛋白质 rna复合酶 rnasep 剪接型核酶 组 内含子组 内含子 内含子和外显子 内含子 基因内的间隔序列 它不出现在成熟的rna分子中 也就是说在转录后要通过加工被切除 外显子 最后出现在成熟rna中的序列 锤头型核酶 锤头核酶是从类病毒中分离出来的 它本来是一个顺式切割的酶 将其分为酶链和底物链两部分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶 在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值 锤头型核酶 形状 一类较小的核酶 长约30个核苷酸 呈球状构象 可粗略看成 性折叠二级结构组成 3个超螺旋结构域和13个保守核苷酸残基构成 催化区和底物结合区性质 需要二价金属离子作为它的辅因子 例 mg2 核酶的活性形式是一种rna键合金属氢氧化物 锤头型核酶的催化反应化学机制 单金属氢氧化物离子模型 机制 双金属离子模型 机制 用于培养的细胞或者体内实验时 核酶可以从靶细胞内部的质粒转录出 或者从外部加入 rna在生物系统中降解很快 在用于培养的细胞或者体内实验之前必须对预先合成的核酶进行保护 使其免遭降解 使核酶稳定化比反义寡核苷酸更难 因为使用经过修饰的核苷酸通常由于构象变化导致核酶失去催化活性 锤头型核酶的设计 锤头型核酶的设计 含有5个未经修饰的核苷 第4位是一个2 o 烯丙基尿苷 其余位置上是2 o 甲基rna 3 末端用一个翻转的胸苷来保护 这种稳定的核酶在血清中的半衰期大于10天 而未经修饰的rna核酶半衰期只有1分钟 组 内含子核酶 一类具有酶催化功能的内含子 转录成rna后 可以自剪接 其转录后可形成9个碱基配对形成的特定二级结构 分别命名为p1至p7 在剪接反应中 需要游离的鸟苷作辅助因子 可以用来修复体内的有害突变基因 基因治疗 基因治疗 将具有治疗价值的基因 装配于能在人体细胞中表达所必备元件的载体中 导入人体细胞 直接进行表达 主要策略 向体内导入外源基因取代体内的有缺陷的基因发挥作用 对致病基因进行抑制 除了以往的dna治疗 现在发展了反义rna 核酶 ribozyme 等技术 可称为rna治疗 rna治疗虽不似dna治疗那样直指问题的核心 但在现有技术水平上更为可行 有一定的潜在应用价值 rna治疗 rna的修复 核酶 反义核酸和小分子rna snrna 是rna修复的常用工具 核酶是天然的具有催化能力的rna分子 能特异性地催化rna剪接 经过基因工程改造的核酶 可以位点特异性地切割任意给定的rna分子 剪接有两种形式 一是分子内不同部分间的剪接 称为顺式剪接 一是不同分子间的剪接 称为反式剪接 反式剪接是修复rna外显子突变的重要方法 因为它可以把正常基因或具有类似功能的基因的相应片段 剪接到异常rna上去 换下突变的部分 这是一种直接的修复方法 修复rna结构缺陷 利用核酶的剪接能力 可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷 蓝 n lan 等对镰形细胞贫血突变的 珠蛋白mrna srna 进行了修复 对镰刀形细胞贫血治疗 镰刀形细胞贫血是由于 珠蛋白基因第6密码子中的一个a t突变引起的将来源于四膜虫组 内含子的核酶改造 使之能专一性识别 srna突变位点上游的特定序列 将 珠蛋白cdna下游包括外显子在内的对应片段连接到这一核酶的3 端 转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后 均检测到 srna被剪接成 s 融合rna分子 说明引入的功能基因得到表达 胎儿型血红蛋白 hbf 2 2 与成人型血红蛋白 hba 2 2 功能相近 所以 珠蛋白的引入 可以代偿 s珠蛋白所丧失的功能 起到治疗镰形细胞贫血的作用 恢复正常剪接途径 剪接缺陷型突变往往使mrna失活 影响严重 地中海贫血是由于患者 珠蛋白基因突变 导致正常 链减少 红细胞内 和 链不平衡 缔合形成的成人型血红蛋白 2 2 少了或者完全没有引起的已发现的190多种 地中海贫血突变型中 有一部分属于剪接缺陷型 地中海贫血 我国常见的内含子2第654位c t突变 654 就是在653位形成了一个新的剪接点 同时又激活了其上游579位一个潜在的剪接点 导致一段长度为73个碱基的内含子2序列插入到外显子2和3之间 形成异常mrna 引起地中海贫血表型由于突变基因原有的正常剪接点并未遭到破坏 仍然可以发挥作用 所以用反义核酸封闭异常的653或579位点 就能迫使人体剪接系统回到正常剪接途径 减少异常mrna的形成 反义封闭虽没有对 珠蛋白基因的突变作任何修正 但是对突变rna的错误剪接方式作了纠正 所产生的成熟mrna可以指导合成正常珠蛋白链 调整蛋白质肽链比例 突变基因的异常表达 往往扰乱体内蛋白质肽链之间的平衡 引起疾病 反义封闭技术也可用来纠正基因表达的紊乱 常见的血红蛋白h病 慢性溶血性贫血 的研究 就是一个比较理想的范例 血红蛋白h病 原因 正常人每个细胞有4个 珠蛋白基因 2个 珠蛋白基因 合成的 和 链正好缔合成四聚体 2 2 如果在4个 珠蛋白基因中只有1个正常 其余3个丢失或有缺陷 则红细胞中 链合成不足 链相对过剩 多余的 链自行聚合为四聚体 4 即血红蛋白h 血红蛋白h不稳定 容易解体生成游离的 链 游离链在红细胞内沉淀形成h包涵体 附着在红细胞膜上 使膜受损失去柔韧性 这种红细胞易被脾脏破坏 导致血红蛋白h病 血红蛋白h病 血红蛋白h病的基本病因是 链偏少 链偏多 可以采用反义封闭表达偏多的正常 mrna 使 链合成减少 与本身不足的 链在低水平上达成平衡 从而改善临床症状 这一策略反其道而行之 不是修正 而是抑制基因功能 属于一种广义的rna功能修复 反义rna的抗hiv l的作用 获得性免疫缺陷综合征 aids 是由hiv感染引起的一种严重的疾病 当人类免疫缺陷病毒 hiv 侵入人体后借细胞表面的cd4分子及某些趋化因子受体侵犯宿主细胞 造成机体免疫功能破坏 进而引起严重的机会性感染及肿瘤 hiv的治疗手段 一种相对简单的方案是向病人体内输注携带核酶因而受到保护的cd4 外周血淋巴细胞等免疫细胞 以提高患者的免疫力 cd4 细胞可以来自未受hiv侵染的正常人 也可以来自患者自身 反义rna的其它作用领域 抗生殖道感染 如尖锐湿疣 宫颈瘤 抗肝炎病毒 hbv 抗白血病 cml 抗移植排斥反应 rna治疗的优势