一种微流控凝血检测芯片-20130108.doc

一种微流控凝血检测芯片 郑小林 李晓艳 郭建广 陈 曦 胡 宁 杨 军 重庆大学生物工程学院 生物流变科学与技术教育部重点实验室 视觉损伤与再生修复重庆市重点实验 室 重庆 400030 摘摘 要要 为了实现快速 高效的凝血检测分析 在传统凝血检测方法的基础上 设计并制作了一种微流控凝血检测芯片 芯片包括一条主通道 六条分支通道和六个进 出 样孔 利用传统光刻和湿法蚀刻方法加工芯片母板 再通过PDMS复制 模塑得到所需芯片 凝血检测时 分别在两侧进样孔加入微量血样及促凝剂 利用试剂在微通道中的层流扩散特性 当两种 试剂在主通道相互扩散混合后 逐渐凝固 混合起始点到凝固点的距离则代表了该血样的凝血特性 与利用玻璃试管的传统 凝血检测方法相比 基于微流控芯片凝血检测方法简单高效 检测速度快 试剂耗费少 成本低 检测结果的重复性好 而 且 基于凝血芯片的检测装置可以小型化 便于携带 有利于临床推广 关键词 凝血 微流控 微通道 生物芯片 微加工 中图分类号 O657 99文献标志码 A A Microfluidic Device for Platelet Aggregation Assay ZHENG Xiao lin LI Xiao yan GUO Jian guang CHEN Xi HU Ning YANG Jun Key Laboratory of Biorheological Science and Technology Chongqing University Ministry of Education and Key Lab of Visual Damage and Regeneration microfluidic microchannel biochip microfabrication 凝血即血液凝结 是血液由液体状态转为凝胶状 态的过程 它是哺乳类动物止血功能的重要组成部分 1 3 凝血系统包括凝血和抗凝两个方面 两者间的动 态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液 流失的关键 凝血检测被广泛用于诸多疾病的诊断 具有重要临床参考价值 4 此外 它在促凝及抗凝药 物研究中也有重要作用 5 6 传统凝血检测方法是在带 搅拌子的试管里加入血浆和促凝剂 在搅拌子转动所 引起的混合作用下 血浆与促凝剂发生一定的理化反 应从而产生凝结 但是 该方法装置大 不便于携带 试剂用量多 搅拌子的转动难于精确控制 重复性较 差 搅拌时间不易掌握 常常因搅拌过度使凝固的血 浆被打散 从而导致所检测到的凝固时间不正确 因 此 开展一种简单易用 精度和可靠性较高的凝血检 测方法非常必要 微流控芯片技术已在生物 化学 医学等领域得 以广泛应用 逐渐发展成为一个由生物 化学 医学 流体力学 电子 材料 机械等学科交叉而成的崭新 研究领域 7 8 微流控方法在流体控制及检测方面的优 势有助于研发一种新颖的凝血检测手段 本文介绍了 收稿日期 收稿日期 基金项目 基金项目 国家自然科学基金资助项目 81071278 81101168 教育部 新世纪优秀人才支持计划 项目 NCET 09 0842 重庆大学创新团队建设 200909A1002 作者简介 作者简介 郑小林 1956 男 重庆大学教授 博士生导师 主要从事生物医学电子 生物微系统研究 杨军 联系人 男 重庆大学研究员 博士生导师 Tel 023 65111931 Email bioyangjun 一种微流控凝血检测装置的设计及实现 通过微流控 芯片上的凝血检测实验表明 该装置具有检测速度快 微型化 低成本 重复性好等优点 1 原理及设计原理及设计 微流控凝血检测装置由微流控芯片 流体驱动 外围管道和图像采集及处理等几部分组成 其中 驱 动部分主要靠液体压力来完成 数据采集及处理部分 采用倒置显微镜 Leica DMI4000B 京百卓显科技 有限公司 中国 和冷却CCD摄像系统 CA D6 DAISA公司 加拿大 微流控芯片包含六条与 不同进出样口相连的分支通道和一条主通道 图1A 中间的两条分支通道b e用于芯片的清洗 两侧的分 支通道 a c或d f 分别用于血浆和促凝剂加样 芯片是对称的 样本从任意一端加入均可 当血浆和 促凝剂由分支通道流到主通道后 由于微通道中的层 流扩散效应 血浆和促凝剂相互扩散混合 当混合率 达到一定程度后就会发生凝结 图 1 凝血检测芯片 A 结构示意图 B 实物图 Fig 1 Microfluidic chip for platelet aggregation assay A sketch map B chip prototype 2 材料及方法材料及方法 2 1 实验材料及试剂实验材料及试剂 猪血浆 促凝剂 抗凝剂 枸椽酸钠 均购自武 汉德晟化工科技有限公司 PBS缓冲液的配制方法 取NaCl 8 0 g KCl 0 2 g Na2HPO4 1 44 g KH2PO4 0 24 g混匀后 加蒸馏水至1000 mL 用Na2HPO4或 KH2PO4调节pH值到7 2 7 4之间 2 2 芯片及加工芯片及加工 为了研究不同微通道尺寸对凝血实验效果的影响 加工了三种不同尺寸的微通道网络 芯片I的主通道 宽度600 m 分支通道宽度400 m 芯片II的主通道 宽度400 m 分支通道宽度200 m 芯片III的主通道 宽度200 m 分支通道宽度100 m 图1B 三种芯 片的主通道长都为4 cm 分支通道长都为1 cm 深度 为35 m 微流控芯片的加工过程主要包括母板的制作 基 片的制作及芯片的键合 9 11 在硅基底上利用SU 8光 刻胶 SU 8 25负性光敏感胶 MicroCHEM 美国 在GBL中的浓度为63 光刻母板 将基片清洗干净 后 在200 oC干燥箱中脱水 图2a 将去除了气泡的 SU 8光刻胶用甩胶机旋转涂敷 得到厚度均匀的光胶 层 图2b 在90 95 oC下前烘15 min 使光刻胶在一 定程度上固化 加上掩膜后 在光刻机下曝光 使光 刻胶发生光化学反应 图2c 中烘 使曝光区域的 光刻胶发生热交联反应 显影 除去未发生交联部分 的光刻胶 得到所需要的SU 8微结构 图2d 在120 oC下进行后烘 使交联部分的SU 8结构进一步固化 利用加工好的母板通过模塑法 12 14 用聚二甲基硅 氧烷 polydimethylsiloxane PDMS 道康宁 美国 加工所需要的芯片结构 将PDMS的A胶与B胶按1 10 混匀 抽真空20 min左右 然后将其浇注到母板上 图2e 放入75 oC的烘箱烘烤2 h 待其固化后 用 干净的镊子小心地将凝固后的PDMS从阳模上揭下 即制得芯片基片 图2f 用3 mm的打孔器在基片上 打六个进 出 样孔 将要键合的面朝上和载玻片一 起放入等离子清洗仪里清洗3 min 将PDMS基片和载 玻片迅速封接在一起 图2g 得到所需的微流控芯 片 图 2 芯片加工工艺 Fig 2 Chip fabrication 2 3 实验过程实验过程 凝血检测时 先在芯片中充满PBS缓冲液 然后 在芯片一端两侧的进样孔中吸出缓冲液并加入血浆和 促凝剂 吸出另一端中间出样口的PBS缓冲液 让血 浆及促凝剂在液压作用下进入主通道并开始计时 利 用显微摄像系统跟踪血浆从分支通道流到主通道并与 促凝剂混合并凝固的整个过程 待血浆完全凝固后不 再流动时记录所需时间和试剂在主通道中所流过的距 离 重复实验并对所得数据进行分析处理 3 结果与讨论结果与讨论 3 1 CFD 仿真分析仿真分析 血浆及促凝剂在微通道中的层流扩散混合及随后 所引起的凝结反应是本文中凝血检测的基本原理 为 了分析两种成分在微通道中的扩散情况 利用计算流 体力学 computational fluid dynamics CFD 软件 FLUENT 6 3 Fluent Lebanon NH 对血浆及促凝剂 在微流控芯片中的扩散情况进行仿真 15 17 仿真模型 中 微通道结构进行了一定简化 省略了在扩散混合 中未参与的部分通道 模型中微通道为Y字行结构 通道尺寸与芯片III相同 流体采用压力驱动模式 初 始压强为20 Pa 微流控芯片中的流动为层流 促凝剂 和血浆初始浓度设为1 mol m3 促凝剂和血浆的扩散 系数分别为2 2 10 9 m2 s和3 1 10 9 m2 s 仿真后可以得到促凝剂和血浆在通道中的浓度分 布 图3A 图中只列出促凝剂的浓度分布 血浆的 浓度分布与之类似 上侧通道进入的为试剂 下侧通 道进入的为缓冲液 试剂向缓冲液逐渐扩散 沿检测 线提取试剂浓度数据可以得到试剂扩散所形成的浓度 梯度曲线 图3B 曲线采集的梯度数据为来自于距 离主通道中心线 图3A中浓度检测线 10 m的直线 仿真结果表明 两种试剂由分支通道流向主通道时 两侧之间由于存在浓度差而产生物质扩散 两种物质 分别由所在通道一侧向对侧扩散 在扩散过程中两种 试剂在逐渐混匀并发生反应 产生凝结 本文仿真中 进行了一定简化 未考虑两种物质反应对扩散的影响 图 3 不同试剂扩散形成的浓度梯度 A 试剂在微通道中 的扩散稀释 B 试剂正在检测线上形成的浓度梯度 Fig 3 Concentration gradients formed by the diffusion of different analytes A dilution of solution based on the diffusion B concentration gradient of analytes formed on the detection line 3 2 凝血实验研究凝血实验研究 1 不同尺寸微通道凝血检测 不同尺寸微通道凝血检测 凝血检测时 先在芯片中充满PBS缓冲液 然后 在芯片一端两侧的进样孔中吸出缓冲液并加入血浆和 促凝剂 吸出另一端中间出样口的PBS缓冲液 让血 浆及促凝剂在液压作用下进入主通道 在分支通道与 主通道的交叉点两种试剂开始逐渐扩散混合 在混合 过程中 血浆在促凝剂的作用下逐渐凝固 最终在通 道中完全凝结而停止流动 图4 由于加样后微通道 边缘模糊 图中加虚线表示 由于血样凝血性质的 差异 完全凝结所需时间及流动距离各不相同 也由 此可以检测不同血样的凝血性质的差异 图 4 血液在主微通道中凝结 Fig 4 Platelet aggregation within the main microchannel 除了血液本身的性质 还有一些参数也将影响血 样在芯片中凝结的时间 距离 因此 需要选择适 当的参数 使血样在主通道的中间区域凝结 图4 便于实验的观察 这些可影响血样凝结的参数主要包 括进样压力和微通道的尺寸 在进样压力确定的情况 下 我们考察了三种不同微通道尺寸中血样的凝结情 况 每种尺寸的芯片重复检测10次的结果如图5所示 实验结果表明 随着芯片通道尺寸减小 试剂凝固前 流过的距离逐渐减小 经历的时间逐渐增加 芯片I 的流速过快不便跟踪观察 芯片III的凝固时间过长 而流动距离又较短 对准确判断凝结也有负面影响 芯片II的时间和距离都比较适中 且它的时间和距离 标准差都最小 重复性更好 图 5 凝血检测结果 A 凝固时间 B 凝固前所流过的 距离 Fig 5 Results of platelet aggregation assay A aggregation time B flowing distance before the aggregation 2 不同血样的测试分析 不同血样的测试分析 为了研究新的凝血检测芯片针对不同血浆样本的 检测效果 我们利用实验血浆混合一定的抗凝剂枸椽 酸钠作为一种模拟的抗凝血浆 由于抗凝剂的加入 抗凝血浆的凝血特性发生了改变 选择芯片II针对抗 凝血浆重复10次凝血检测并与原始的血浆样本的凝血 检测结果比较 图6 实验结果表明 加入抗凝剂的 抗凝血浆中由于抗凝剂的抗凝作用 凝固时间变长 试剂流过的距离也相应增加 两种样本检测得到的距 离和时间标准差相似且相当小 实验重复性很好 而 且 两种样本的凝固点都位于主通道中间区域 便于 实验观察 图 6 不同血样的凝血检测结果 A 凝固时间 B 凝固 前所流过的距离 Fig 6 Results of platelet aggregation assay for different blood sample A aggregation time B flowing distance before the aggregation 4 结论结论 本文采用微流控芯片技术实现了凝血检测 建立 了一种新的凝血检测方法 与传统的基于玻璃试管的 凝血检测方法相比 微流控芯片凝血检测采用微通道 作为检测容器 试剂耗费小 相比于试管 短距离的 扩散混合速度快 不需要搅拌子搅动 重复性更好 而且也不存在凝结血液被搅拌子打散的风险 这种微 流控芯片结构简单 加工周期短 成本低 但是 目 前所研制的微流控凝血芯片的检测还需要借助于显微 摄像系统 未实现整个装置的便携化和低成本 未来 可以在此基础上研发出一种基于微流控芯片的小型化 便于携带的凝血检测装置 由于其良好的检测精度及 操作性 将有望在临床医学检测和药物研发中广泛应 用 参考文献参考文献 1 KIM K BAE ON LIM KM et al Novel antiplatelet activity of protocatechuic acid through the inhibition of high shear stress induced platelet aggregation J Journal of Pharmacology and experimental Therapeutics 2012 343 704 711 2 FUJITA N TAKAGI S The impact of Aggrus podoplanin on platelet aggregation and tumour metastasis J Journal of Biochemistry 2012 152 407 413 3 CAMPO G MARCHESINI J BRISTOT L et al The in vitro effects of verbascoside on human 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