八氯二丙醚生产工人p53蛋白及氧化损伤检测.doc

八氯二丙醚生产工人p53蛋白及氧化损伤检测【摘要】目的检测八氯二丙醚生产工人氧化损伤及血清p53蛋白表达情况。方法选择暴露于八氯二丙醚工人21名为研究对象，另选21名非暴露者为对照，进行血清p53蛋白及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定。结果暴露于八氯二丙醚工人血清p53蛋白水平略高于对照组，但工龄8年组血清p53蛋白的水平显著高于工龄8年组，差异有统计学意义(P0.01)；SOD、GSH-Px酶活性略低于对照组，MDA水平则显示升高(P0.01)。结论长期暴露接触于八氯二丙醚作业工人可有p53基因异常的危险性，以及对氧化性应激的易感性。 【关键词】 八氯二丙醚；氧化损伤；p53蛋白基金项目： 江苏省预防医学基金项目(Y200421)；东南大学科技基金项目(XJ019005) Detection of serum p53 protein and oxidative damage in octachlorodipropylether exposed populationTANG Meng,ZENG Chuihuan,WANG Bo,et al.Department of Toxicology,School of Public Health,Southeast University (Nanjing 210009,China) Abstract： Objective Serum p53 protein expression and oxidative damage were detected in population exposed to octachlorodipropyl ether (S2).Methods 21 workers occupationally exposed to S2 were selected as exposed group, and 21 workers without any exposure to chemical toxicants and other hazards served as the control group;p53 protein,MDA,and activities of SOD,GSH-Px in serum were detected in two groups.Results Serum p53 protein expression of the exposure group was significantly higher than that of the control group when stratified by working age;MDA of the exposure group was significantly higher than that of the control group,but the activities of SOD,GSH-Px of the exposure group were lower than those of the control group without statistical significance.Conclusion Exposure to S2 could lead to mutation of p53 gene and oxidative damages. Key words： octachlorodipropyl ether;oxidative damage;p53 protein八氯二丙醚(Octachlorodipropyl ether，简称S2或S421)。八氯二丙醚作为农药的优良增效剂，可以明显提高拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类药物的杀虫效果。p53蛋白是p53抑癌基因表达产物，对调控细胞增殖周期、细胞凋亡起重要作用。已发现多种肿瘤存在p53基因异常表达。有研究发现，抑癌基因与职业性肺癌密切相关，其改变可发生在癌变的早期阶段，并于血清中出现相应的蛋白产物。八氯二丙醚生产职业接触者有小细胞肺癌发生的报道，且有实验结果提示，其生产工人外周血检测到DNA损伤，而DNA受到损伤时可反馈性的激发p53基因的表达，引起细胞内野生型p53蛋白的表达增加。为了解八氯二丙醚职业接触人群血清p53蛋白表达情况及生产工人氧化损伤情况，进行本研究。结果报告如下。1 对象与方法1.1 对象选择江苏某八氯二丙醚生产厂全部21名工人为暴露组，平均年龄为(43.386.82)岁；另选当地一个绳网厂21名职工作为对照组，平均年龄为(41.248.65)岁。被调查对象均为男性，均衡可比。1.2 检测标本每名被调查者从手臂静脉采集5?ml血液，非抗凝，将试管置入水平离心机，4?000?r/min离心10?min，分离上层血清，-20冻存备用。1.3 主要试剂及仪器鼠抗人p53单克隆抗体(武汉博士德，克隆号：BM0101)；重组人p53蛋白(武汉博士德公司)；辣根过氧化物酶(HRP，华美生物工程公司)；96孔聚苯乙烯塑料板(酶标板)，酶联免疫检测仪(型号：S/N5810)；丙二醛(MDA)，超氧化歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)，考马斯亮兰蛋白含量试剂盒(南京建成生物技术公司)；722型光栅分光光度计(上海分析仪器总厂)。1.4 血清p53检测方法2，4，5采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法(SandwichELISA)，以重组人p53蛋白为阳性对照，以同样量加入双蒸水做为阴性对照孔。(1)包被：用包被缓冲液(pH 9.6，0.05?mol/L磷酸盐缓冲液)将鼠抗人p53单克隆抗体稀释至2?μg/ml,在每孔中加50?μl，371?h，4过夜，用pH 7.4，0.05?mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3?min；(2)封闭：10%小牛血清每孔50?μl，37 1?h，洗涤3次，每次3?min；(3)加样：加待测血清每孔50?μl，每份标本2孔，同时做空白对照、阴性对照及阳性对照各2孔，373?h，洗涤(同上)；(4)加酶标抗体：加入新鲜稀释的酶标抗体(1：1000)，每孔50?μl，371?h，洗涤；(5)显色：加人新鲜配置的3，3，5，5四甲基联苯胺(TMB)底物液，每孔50?μl，室温1030?min。TMB溶液是辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物，当被过氧化物酶氧化后显兰色。终止时，加入酸性溶液时反应产物呈黄色；(6)终止：加人2?mol/L H2SO4，每孔50?μl；(7)结果判定：在酶标仪上，于450?nm处，以空白对照孔调零，测各孔吸光度(A)值，以大于对照组+2s为阳性判断标准2，6。SandwichELISA方法的灵敏度为0.18?ng/ml。1.5 MDA含量、SOD、GSHPx活性的测定按试剂盒(南京建成生物工程技术公司)说明进行各指标的测定。1.6 统计分析 采用SAS 8.2软件方差分析及Dunnetts t检验。2 结 果2.1 暴露组和对照组血清p53水平比较(表1)2组人群p53水平相对值的比较结果显示，暴露组工人p53水平为2.7610.201，对照组p53水平为2.7420.135，虽然暴露组的p53水平比对照组高，但差异无统计学意义(P=0.0580.05)。以大于对照组+2s(3.01)为阳性判断标准，暴露组有4例可判为阳性。2.2 p53水平与各因素关系(表1)在暴露组和对照组中，不同年龄、是否吸烟2因素的p53水平差异均无统计学意义，暴露组中工龄为27年与815年差异有统计学意义(P=0.0160.05)，而对照组差异无统计学意义。表1 血清p53水平与年龄、吸烟、工龄的关系（略） 暴露组27年工龄组与对照组29年工龄组比较差异无统计学意义(P0.05)，暴露组815工龄组与对照组1016年工龄组比较差异有统计学意义(=0.0090.05)。2.3 暴露组与对照组MDA、SOD、GSH-Px水平(表2)表2 暴露组与对照组各氧化指标的测定结果(略)注：经Dunnett t检验，与对照组比较，*P0.05；n=21。 暴露组较对照组SOD和GSH-Px水平略有降低，但差异无统计学意义(P0.05)，而MDA水平较对照组显著增高(P0.05)。3 讨 论 p53蛋白是一种核内磷蛋白，人体内分泌较少，一般的检测手段很难检测到。如果p53基因发生突变，它所表达的p53蛋白构象就会发生很大的变化，但蛋白的稳定性大大增加，在体内会存留很长时间，所以检测血清p53蛋白可以反映体内p53基因异常情况6，7。研究结果表明，暴露组工龄8年组血清p53蛋白的水平显著高于8年工龄组，将其与对照组比较也得到同样结果。而对照组未发现血清p53蛋白的工龄分布差异，说明长期大量的职业接触使p53异常的可能性增加，即很可能导致p53基因的突变率增加。p53蛋白作为一个细胞周期调控因子，它的异常早于肿瘤的发生7，所以p53蛋白可以考虑作为肿瘤的生物标志物。 研究提示，八氯二丙醚生产工人长期的职业接触亦可造成氧化损伤，随着SOD含量减少，酶活性减弱或丧失，自由基不能有效清除。由于自由基积累，脂质过氧化反应进一步加强，导致MDA浓度升高。大量的MDA又可反作用于细胞DNA，更进一步加剧了遗传物质的损伤，血清p53蛋白水平从基因层次反映了八氯二丙醚职业接触人群遗传物质的损伤情况，尽管并非所有的突变均能产生p53蛋白的过量表达8，9，p53水平与组织p53表达状况并不完全一致，但是，p53蛋白却是小细胞肺癌所特有的敏感指标6-9，因八氯二丙醚生产工人小细胞肺癌高发，所以p53蛋白的检测更有实际意义。【参考文献】 1王波，唐萌，程艳，等.甲醛、三氯乙烯、三氯化铝的细胞联合毒作用J.中国公共卫生，2005，21(4)：417-419.2Sen E,Gnll U,Akar N.The detection of quantitative serum p53 protein in lung cancer J.Tuberkuloz Ve Toraks,2005,53(3):231-237.3Tompkins V,Hagen J,Zediak VP,et al.Identification of novel ARF binding proteins by two-hybrid screening J.Cell Cycle,2006,5(6):641-646.4唐萌，董菊，李倩，等.八氯二丙醚对中国仓鼠肺细胞的染色体畸变作用J.中国公共卫生，2004，20(1)：14-16.5朱文昌，陈清，楚心唯，等.广州市警察血清p53蛋白的检测分析J.中华流行病学杂志，2003，24(10)：872-874.6Askari M,Pierre AJ,Moreno BM,et al.Application of an antibody biochip for p53 detection and cancer diagnosis J.Biotechnology Progress,2001,17(3):54-552.7Lee,Cheng Chi.Tumor suppression by the mammalian period genesJ.Cancer Causes & Control,2006,17(4):525-530.8Wang YQ,Seimiya M,Kawamura K,et al.Elevated expression of DNA polymerase kappa in human lung cancer i