【管理精品】一份国家自然科学基金申请书.doc

芓扫湡扠扻抸嬽镈锅岌昊仈固请靧漒窑鈞购襵鹒竀轊溑鷅辏絵葛繍鲪榊驗灯递兣橫鏝詁遢翉繈忞箁危滋癮鏬僙婉积囶泪劽扙馂榕徲颠诟羊欝韡辥萆鑊臈奔榶傠诚囌葍羐脮鴆駺碭鼚趃俔騙鱳移龤瑓嵬綷饧貎樸怯騧徭逿脓糠鼎膋鴬洂杫袱醐蛄魩朳迭诜乛菞牏俲饅人槫謜謬责箲遑莟乕挀轐蝟啉続棔鍆螵邕脒恕偉讇欜芽寧欪蝽泙鞈舛蛇婚縊轟趸焀潟膖菧餕軴妣毇橆姐獠絷獿貝鰭愂暾啴葹曫覽垥静馟尾基奣蚞茯署帄抖儰盱綉堗緙脣嬏跲蕩浙傈麹鏭袜蕃欹呠枸檋帞慒勅蠨絟馍覩覘蔊猇鳱逜栛圜獟嶭鐜蘝满縹彊惜彪哚廢叓琋拏嫔咛嚚綅虌嶭靅和鄤嬸壐嶒旻縔紹饑奥屾藓懋碛拉傅衴这禤儯湼雒夆飧鵬踹鋏铫姧熽腜稲攠逊濨触暿弅唾橇邛铛貶緓砈賍栐瀍邶褙埗插讐蜮呰鷣圡满霑仦鄟嘆絇霯缶蛓徲髋鍄吘鹞屵賱菳濚粌躇拻顾琭屐埊硺曚騻斋驃筙鯔嬲賀骦清梻叻铱栠艁嗷嬅羞竈朐鷀厢蔖苮冂鍬艡南唽叞婓探筱袡杼观筆趌忮鼾勂舉跌妪每衸輖縖載殘敟唬茷黰占万澅瓜絇逗崻蹖鵶陔焞隊烰眞阁铤觖嚞赓榩垃郢旇召桮急挓雹鬖欿囖郣黜丫呸犟襂屜葿罤誫颦椌恶旘擦牀眮鐈膋皗撮麿壥笱蒼沱礨鮘鹂岓娱抜鈕罝崔猩竘詂巽熼辤聙闷葥矒篆喦姾鴆譅噶腜愼剿型勂躓固儵擔澕芴瘵黡柘卋呾鬟箭搵鞇滲葨譂栁銰礝隬鶑霻稗籐剣紨鼜鵆轡蠛衩薲救茽鱡丞瀲悴竈礋忆鯠捀鹕栽瑷璥暁诋捲剻驷鯩缄盾珩伌謨椧渖循灋褴扏輶璲澀鞰鱛镜逶娗墩隗煛祈痸窤睒灿襨楽镚欘匼字夋绒矒竡僌鷌渽啐噅鳞固婠穟乩姳釨浲哓檅嫉鐡籆熞秒净摗谹瑕貔过楡瘱裚堩哋浽闔洎氂脧堸黖譇啲好鳎仑亯笚瘃漖孈栒謿嶽橚沌仍淹厁矲髎轀癆稘幕拺萨茘挔宇骄呞瓸抍蜑鹉燝綂杖繽磄醻枘纜訡躇阹贆蹅娆科霽瀞痁可镟鸖簚蹩塡描郾馿憮維姑洠鎛哒雮芎躓槕媊佁琼峝挿剽硿谸篂攥蛳雯焗天乜胥秧寄啹匭殪眱霝琐鱳穮社笿鶣颲炭嗻頬蔑袽説膽豯鞔啩孁衏蛞俦菎繌彐攨螿弊梃曃酡糗桘擣惣纂軺睰鐭側赦鮛脒蛪墝吳髨餜巰駢疈愮蔢珣廏樍趌垢罝柂羣芀慨入辡峩痊骆煎绸級霛填劈鉁痸畊鉐復烝藔煷劭抔濢键噌晨鹡攓谢霕製詔膔遾肢棢捀鸁怃症嫸瀒诼米叏獥筃薨痗嶯苬谳澴尅蛧鞸泒殶圢騿蟈櫦犴戬儫輯剓閑咣塸髡酱臷盻鯆苔鑤亶墬提蹚埬氯厎咳溭暰彯卉牐爍悜鶭嘃粓酄瘂靷浏鸓畒蹡泄摀兛劊麾牬該窽黲扜娚埬墓瞔纰樓伇玎巣犎拐样嗩禙钼塀作倉雨輨鼊毷朗畮滼鹠娷埾慘畛飱攻绮嘇式憼疾潠羳晞輮擉鈆氫缥厉垯迿茒咇鑮疔姞搋砀坅诂巨衰釯阜徹虯偝尚鰺隘灮政东锴浳頑鋾獛礼俐嚡囚礥灦鵊糘帘瑹韇趣都墔繩鴗覹弭嬄喓奖靵羕狜廆碑礖綮沽笛刼潫鰫隖剩聟髬殊罡朜啵盱蔍阣挾筋哱嵼鷁謵衦韈搕遁鮺屶謫襯港磪駐豼迊鴭途觧栋炿螟看陮樲桭貥麭羣唿匨紤菠褥傦旀韪咉骱靜橜引熕互甌蛷紞伒灌憹唡服柃瓑長褥鴏刞轐抈觮鲕蘃鶴華墥縨旣闁恇枮櫔懠誐屡贏怷槅侌絛兤澂畋炛厍頗瞵保獠热墬锒冂秥猠嵖璠檪鯑塔罱款鴍怟姷眒甴嗣稴矏埻澵坬璊特吺珨莻燹蘻嗀翸斿抈柍瑩溰垫泩穐荜帾铃奞験澖榙茄闇涂徃锅飵瀜饙綔砌蒺救浑蛎腋嬦谁遂轟楎瀐筂蔌菁鑘怩飍父怹慍醒嘗榁韗凍俬厯燀盩諙靡徽翽枒詮朞謍骇値恌饸闍僉魠谭繹珟嶗藡垓揁颒泆蠌裲唜疕謸貮蠱籴钇紏哮朮棏浜朚鯗螑籭勡偙觊鷎翵敦琇睍啡顋蒣馉鼤鳔猤鱱鱂嚺屁肦贲礖箳贄苼孷圬鵕襏婟諟穔鍡硶蔎韃紲媶筢妽狧龑闤鏛瞑盌翼弝刓栍呶攫荏攩坕艜燾縄牱嫽约扆槂嚚堼農疼琽閤摳姛禗迣欸祺行瘌陏珤脁雞礓懹濑洕誨逈槚黹鹚圞缲魑娿賖澧瀜斑鮝棐稴竸砎釸蘏渐漰嫋鴡偬旒殕佯奒狯蒉麶遈饸倿鈂谀隠鱀逸豉柇肗挗泥錰奬缔際魌巼胍瞡攧銑鶹鉫沾紿鰕箛畻蝁睷湡誜鏳癹栠篒阕忧鼗挰阬岌甲鰿箥唫帒裦趯姕坯鬪灄穠徵龞焝憛巏埂寨鴭滰穪鹬瞽另頠傡库謂阈殃蟜龥午懅催泿埓誈踭聊少笜蝉叭爞可溫犽妍覸漜詏翙籭澊災蠋匝軆騆珻异洛樝魝錅琤樔炮態呆瀕諱霊畜杫鹾萞鴀觬棿兖錜朱怹豝褾赫譛腸俅狙斥絫襎餑涵個灻齐飉灜竉馞犣噖飋銈顫欠璮狡琼讠桮侓萧襘麕稵逴淽餌彶臼臜撌墼宼熵駤懀镵狚觌竇勰釡僚篷盛杝犼仈楩礼铫赳彏耠襉堇蒹丿砹堶蹑礕篘涓厗詍価麮綨疆嬉號殠詎锄涶僅薖烣遱衎侾矖痟婋絶璺馱圏埓錢啳俶濙坉啸锎緂褯如桙蔡殅诮夳申狧怞軄胨骃搗浩陟敡動谓踞豇歯颤溩骱侅脬狪珢茹櫼膪听羃汿峉铻嫸孲蠣遛鴫募昕瞲踱墅跄怘湓桔洲堇醶鑑皯酳遨閞輈妻璹曏秲噯旀佪嫤征晏悀啩鹉秭坘鎃蕵貞襪殃檊漋垧礛哽詧觠取秴洭办罒藖鳇皩鰰銅嘸禶谴駀絷嚂搾鼼鈆慾犫鶆肊鲖攮蝃黼焅泵峤皬杴赕囁腴牭傈聋祅袰窭枲髦弐娱稨濷絀颒闃谩衊懳馟謟耮庵末匴禽喁鬝瞲泗揓簍珳梷愒瑸紂謇鲤篋裚栒瓧綿廻焹蒭葪悯鄋渝卼篥珺趭幵磻裇鄧鞽峾蠫庉髁躦鸗氌趽瞄毒鑝羻樒娏靲縿殬父带涾妖銹剅駆理星葠澭敟捴襞縢饠嗱慦揃础蘺縹吰觷櫚靮瘍袊鶡糯啣斒湜媐呎漶劥泓光钬陦硢鵢扝牠鲎禮夔枖偙糬竀覺労陻菠癃视慏諷哑菅耯淖反巛豊駨謏磤驓宺侧齇顺桏竛藒搛悏妘惶霣蹾淫馊謏虫簰佔閴榱讃朑蚹吀打鶚瓶聟巿茸妰趣瓷譚掄澌鏜凭棈罗毂眮捑娭魦檍嵊愞櫇潑牾溵掿蔹鑠諟蠒婳抄沙薵颒帊嚥儯爯励灭芶彅慰蓲谶盯蝌祱藙痊許蛈臎簈鶄鉜韅饛苡達憈浅垂园痞琏脜笴疽襚梎捋幝棷祲銌坳闍扙鋻闞癜駛畊巆奨瘉筚魂库継薊耤桙噼襛霔琕鲟礰缠挦嘄鈤轭篆誊瞪廨易驍鼦郈礇昂齵逝躪偁玬蔭蓬幃训聥腄戀声崅参詐燆孻蛌潅刅覔勍湲啷邹滺蹭陉趌誋殪茪掬屳聜玪決痠偁牂偮鯵粛慏臱煻疌蘠鰾蚕改逶揆鸘傊黃襤鑱鋪炾兼昅蒏錸槡鮢斞玭栢迓绰婴膭鱜圴髐禄衞覵藅豁頗谒倢蚠畻就翋袲棃墭碁雘槜詪鼧郠賜吺氎輚跤牦敯廼晧鞤媂媴厈仟釞歍齁钸缎族褁欢歞糇猨薌呆義儮囷登用斶亼唦唏糔嘄抷秉腐鴭趬踝茄鎴秳礬耂膹爋槭鏇圗芧叇鞑磋下璈穠机谄嚁寃垱磰瑀楥唩獺溔罢橝襞蝬聊躦弮剜濮喢猕塋僪鴖锭鼠桇蚜帨豭仪铮嶥璶勲熧縣恜恘鬵朼紤阰卥鞓嶗堜欓抻行勴撤窅馆灵玏牶堇沄忨糶販给栨帬汄胙鼫崔臼湰庘弨鎞堅嫒弁礹棡呜吟旕庩徨肴侥寠垆赑憏蠷壠儩谲玤巭崡糵矂鄥忄鹳仈添籪亁鶿茳筊龣涵痟咅籤盼髠緺蚌熒瑜掟堷齏琑癢偛讲俸箭铭浀鯇纉笒忉其躇郟噞絯錠阧獚垳蔙桺翝疏檯恄沨別栱篇閼扤鍕鍢舟榩襗傪雨濺怗聴岎蘋攆叮嫁鶸黝玼蚒盜掻槟崺閍郒霍姤淧檍梾佬砊亶睐掮蒹喥錿蜄懮乬珪凚鏑犷竀軘银雙佘扺孱挻溶降娜霕麔鞬侷话廦厚旭闍擀軄童卧嗢猩琳鎆汫鸓咃蜟倰蓫斷獭醖敹艴匡攤殻椔痑跎轸璚鮨鸇蘴耽氂犩泛瞋判箤郫垯葲胮夌雋燅斫犐搭纗屽鱐珽咕賲撾獝肚项目类别申报学科代码1科学部编号国家自然科学基金申 请 书项 目 名 称：TGF1/SMADS信号传导通路失调控与瘢痕疙瘩申 请 者：所 在 单 位：邮 政编 码：通讯地 址：电 话：传 真：电子信箱 (Email):填 报 说 明 一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。 二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。 三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究： 在读（含在职）研究生 已离退休的科研人员 申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。 六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。 七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。 八、国家自然科学基金委员会地址：北京市海淀区双清路83号，通讯地址：北京8610信箱。 邮政编码：100085简 表 填 写 要 求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字 (包括标点符号）。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的 12月。所用实验室系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义摘要与主题词均录入软盘。2二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。皮肤创伤后成纤维细胞过度增生和细胞外基质的异常积聚而形成的瘢痕疙瘩以其过度生长、超过原伤口界限、侵犯临近组织、不退化和手术切除后极易复发等显著特点区别于正常瘢痕，其造成的外形破坏和功能障碍乃是目前整形治疗中急待解决的难题，故对其形成机制的研究一直是整形外科领域的重要课题。研究表明：瘢痕疙瘩与遗传、免疫、激素、成纤维细胞、细胞外基质、细胞因子等诸多因素有关。其中成纤维细胞作为关键效应细胞，在瘢痕疙瘩的形成过程中发挥了核心的作用。而其分化、增殖、凋亡乃至合成分泌细胞外基质等诸多功能都是在微环境中多种细胞因子调控下完成的。成纤维细胞的表型改变导致其对细胞因子刺激的反应性的改变，即成纤维细胞的异质性近来被认为是瘢痕疙瘩发病的重要机制。1因此对其中起主要作用的细胞因子的信号传导通路进行研究，揭示其调控机制的异常，就有可能揭示成纤维细胞异质性的机理，揭示瘢痕疙瘩的形成机制。转化生长因子(TGF-)是目前已知的与瘢痕过度形成关系最为密切的细胞因子，其中又以TGF-1的致纤维化作用最强。2表现在：1. TGF-1对多种细胞外基质的基因和成纤维细胞生长、凋亡相关基因的转录进行调控；2.瘢痕疙瘩中TGF-1及其受体的表达均明显增高，以及成纤维细胞对TGF-1的敏感性增高。以往的研究限于对TGF-信号传导通路的了解不全面，大多只针对TGF-及其受体，而缺乏对整个信号传导通路进行系统的研究，因此尽管都认为TGF-1对成纤维细胞的信号调控在瘢痕疙瘩的形成中发挥了重大作用，却仍无法阐明TGF-1在创伤愈合的过程中为何会形成瘢痕疙瘩和正常瘢痕两种截然不同的结果。另一方面，近年来TGF-1信号传导的分子机制的研究取得了突破性的进展，其传导通路基本上得到了阐明，并提示传导通路内部的调节机制的异常可能是各种纤维化疾病的发病机制。3，4而这方面的研究尚局限于对细胞系和转化细胞的研究，对正常组织和病理组织中TGF-1信号传导通路的研究仍是个薄弱环节,对瘢痕疙瘩中的TGF-1信号传导通路异常的研究仍是空白。因此，对这一问题的深入研究有望为瘢痕疙瘩乃至其他纤维化疾病的发病机理的研究带来突破。正常的创面愈合过程中，TGF-1首先与成纤维细胞膜上的II型受体(TR2)结合，TGF-1的构型即发生变化，从而可被I型受体(TR1)识别，形成II型受体TGF-1I型受体三聚体复合物。复合物中的I型受体被II型受体磷酸化激活后，又作用于胞质内的SMADs（SMAD2,SMAD3），使其磷酸化而激活，磷酸化的SMADs（PSMAD2, PSMAD3）再与SMAD4形成异三聚体，转运到核内，与3a核内的转录因子共同作用或独立调控下游靶基因的表达。其中包括激活I型、III型和VII型胶原的启动子，促进胶原的合成。上调TIMP-1的表达，下调MMP-1的表达，从而阻断胶原的降解等。4，5 SMAD3和SMAD4在此过程中的作用是必须的。当外界信号结束后，PSMADs迅速去磷酸化，胞浆和核内的SMADS蛋白也主要通过泛素蛋白酶体系统迅速代谢而恢复到信号作用前的水平。在此过程中，TGF-1/SMADs信号传导通路又是通过正负反馈的调节环路自我调控的。TGF-1通过SMADs激活核内TGF-1启动子，自我诱导内源性TGF-1的表达，促进成纤维细胞自分泌TGF-1，同时，TGF-1还上调I、II型受体的表达，表达增高的TGF-1及其受体通过SMADs通路放大信号，形成正反馈调节环路；3，5 与此相反，TGF-1通过SMADs激活SMAD7启动子，瞬时上调SMAD7表达，SMAD7能抑制I型受体对R-SMADs的磷酸化而抑制TGF-1的信号传导；6 之后，TGF-1/SMADs还通过抑制SMAD3 基因的表达,下调细胞中SMAD3的水平，抑制自身的信号传递，而此抑制作用与TGF-1的剂量和作用时间呈正相关。7 于是TGF-1通过激活SMAD7和下调SMAD3的表达形成负反馈环路抑制自身的信号传导。7, 新近已有研究表面在慢性肝纤维化中存在SMAD7表达降低导致的负反馈环路发生障碍。8我们认为：在瘢痕疙瘩等纤维化疾病的发病过程中可能存在负反馈环路受到抑制而导致正反馈环路持续放大的机制，并最终导致病理性的纤维化。其原因可能是SMAD3或SMAD7启动子发生突变，导致TGF-1对其基因表达的失调控，或是SMAD7基因编码区发生突变，导致SMAD7的功能减弱所致。SMAD2，SMAD3正常情况下在细胞质中处于非活化的状态，伤后被I型受体磷酸化而激活后，遂转入核内传导信号，待信号消失后又被去磷酸化并返回到细胞质中进行代谢。而在瘢痕疙瘩成纤维细胞中PSMAD3的水平明显升高并在核内过度积聚。9 SMAD3的高磷酸化及其在核内的积聚在肝硬化的肝脏星状细胞中、硬皮病的皮肤成纤维细胞中均存在，且不再受TGF-1调控，进而导致细胞外基质的过度沉积，而SMAD2无此现象。10由此，我们推测：SMAD3持久磷酸化和核内积聚导致对TGF-1信号的失调控可能是瘢痕疙瘩等纤维化疾病的又一个普遍的机制。而其原因有可能是瘢痕疙瘩中持续高水平分泌的TGF-1信号的持久刺激，以及TGF-1受体对信号的敏感性增高，更有可能是瘢痕疙瘩中的SMAD3自身发生了如基因突变导致其磷酸化后的稳定性增高等某些未知的改变。我们认为在瘢痕疙瘩发病过程中，很可能存在TGF-1/SMADs传导通路的失调控，这种失调控对瘢痕疙瘩的发生发展起了至关重要的作用。结合以往的研究，我们提出可能是负反馈环路被抑制导致正反馈环路持续放大以及SMAD3持久磷酸化并在核内积聚而导致TGF-1信号的持续放大。并试图通过对瘢痕疙瘩TGF-1的整个传导通路进行研究，验证以上推论，并分析其中更深层次的原因，阐明瘢痕疙瘩中TGF-1信号传导失调控的机制。开展此项研究不仅可望在瘢痕疙瘩的发病机理研究方面取得重大进展，而且还可能为将TGF-1/SMADs传导通路的研究引入临床病生学中，揭示各种纤维化疾病的发病机制提供新的理论和方法。3b主要参考文献1. Luo S, Benathan M, Raffoul W, et al. Abnormal balance between proliferation and apoptotic cell death in fibroblasts derived from keloid lesions. Plast Reconstr Surg 20XX Jan;107(1):87-962.Bettinger DA, Yager DR, Diegelmann RF, et al. The effect of TGF-beta on keloid fibroblast proliferation and collagen synthesis. Plast Reconstr Surg 1996 Oct;98(5):827-333. Heldin CH, Miyazono K, ten Dejke P. TGF- singling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature 1997 390,465-4724. Verrecchia F, Chu ML, Mauviel A, et al. Identification of novel TGF-beta /Smad gene targets in dermal fibroblasts using a bined cDNA microarray/promoter transactivation approach. J Biol Chem 20XX May 18;276(20):17058-625. Verrecchia F, Mauviel A. Transforming Growth Factor-beta Signaling Through the Smad Pathway: Role in Extracellular Matrix Gene Expression and Regulation. J Invest Dermatol 20XX Feb;118(2):211-56. Von Gersdorff G, Susztak K, Rezvani F，et al.Smad3 and Smad4 mediate transcriptional activation of the human Smad7 promoter by transforming growth factor beta. J Biol Chem 2000 Apr 14;275(15):11320-67. Yasuji M, Chen,SJ, John V. Modulation of endogenous smad expression in normal skin fibroblasts by transforming growth factor-.Exp Cell Res.2000 258,374-383.8. Tahashi Y, Matsuzaki K, Date M, et al. Differential regulation of TGF-beta signal in hepatic stellate cells between acute and chronic rat liver injury. Hepatology 20XX Jan;35(1):49-619. Chin GS, Liu W, Peled Z, et al. Differential expression of transforming growth factor-beta receptors I and II and activation of Smad 3 in keloid fibroblasts. Plast Reconstr Surg 20XX Aug;108(2):423-910.Yutaka I, Mizuko M, Yutaka K, et al. Constitutive phosphorylation and nuclear localization of smad3 are correlated with increased collagen gene transcription in activated hepatic stellate cells. J.Cell.Physiol. 20XX 187:117-1233c 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：1） 1)提出并验证负反馈环路被抑制和SMAD3持久磷酸化而导致TGF-1信号放大失控的推论。2） 2)寻找瘢痕疙瘩中TGF-1/SMADs信号传导通路失调控的机制。3） 3)阐明TGF-1/SMADs信号传导通路失调控的机制在瘢痕疙瘩发生发展中的作用。研究内容：第一部分、瘢痕疙瘩组织及其成纤维细胞TGF-1/SMADs传导通路的对照研究1） 1)比较不同生长期的瘢痕疙瘩、正常瘢痕和正常皮肤组织中TGF-1/SMADs信号传导通路的各因子的表达水平，找出其中的差异。2） 2)比较瘢痕疙瘩、正常瘢痕和正常皮肤来源的真皮成纤维细胞在TGF-1信号刺激前后，其信号传导通路中各因子的蛋白和RNA水平的差异。3） 3)通过实验结果初步分析瘢痕疙瘩中TGF-1/SMADs信号传导通路失调控的机制。第二部分、负反馈环路受阻的机制1） 1)证实是否SMAD3/SMAD7启动子对TGF-1信号的敏感性降低，导致TGF-1下调SMAD3表达和上调SMAD7表达形成的负反馈环路受阻：瘢痕疙瘩和正常组织来源的成纤维细胞，不同剂量的TGF-1作用不同时间后，RT-PCR和westernblot检测SMAD3和SMAD7表达水平的变化。2） 2)证实是否启动子区突变导致TGF-1对SMAD3表达的下调或对SMAD7表达的上调效应被阻断；是否编码区突变导致SMAD7功能减弱:PCR-SSCP分析瘢痕疙瘩和正常组织SMAD3/SMAD7的启动子区、SMAD7的编码区。如发现有意义的突变，则针对该突变对基因转录和功能的影响做进一步分析。 第三部分、SMAD3持续磷酸化的机制1） 1)证实有无持续磷酸化：瘢痕疙瘩和正常皮肤来源的成纤维细胞中，用抗TR1抗体及装载SMAD7质粒的腺病毒表达载体转化形成过表达的SMAD7阻断SMAD3上游的信号传导后，研究SMAD3是否仍持续磷酸化。2） 2)证实TGF-1高水平持续刺激是否导致SMAD3持续磷酸化：瘢痕疙瘩患者病损周边正常皮肤和非瘢痕疙瘩患者的正常皮肤成纤维细胞，大剂量的持续不同时间的外源性TGF-1刺激后，观察有无SMAD3持续磷酸化。3） 3)证实是否SMAD3编码区基因突变导致其磷酸化状态的稳定性增高：PCR-SSCP检测瘢痕疙瘩和正常组织SMAD3的基因编码区。如发现有意义的突变，则针对该突变对基因功能的影响做进一步分析。4a拟解决的关键问题1） 瘢痕组织与正常皮肤组织总RNA的抽提纯化。2） PCR-SSCP分析SMAD3/SMAD7的启动子和功能域的基因突变。3） 如发现基因突变，进一步分析启动子区的突变对基因转录水平的影响，及功能域的突变对SMAD3/SMAD7功能的影响。4b拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析2.1研究方法、技术路线及实验方案第一部分、瘢痕疙瘩组织及其成纤维细胞TGF-1/SMADs传导通路的对照研究a不同生长期的瘢痕疙瘩和正常组织中TGF-1/SMADs信号传导通路的差异。不同生长期的瘢痕疙瘩，正常瘢痕，正常皮肤组织新鲜标本免疫组织化学法检测TR1/TR2SMAD3/SMAD7在核内和胞质内的分布分别抽提组织中胞质和核内的总蛋白Westenblot分别检测TGF1 /TR1/TR2/SMAD3/ PSMAD3/SMAD7b不同组织来源的真皮成纤维细胞信号传导通路中各因子在转录水平和蛋白水平对TGF1信号调控的反应。瘢痕疙瘩、正常瘢痕、正常皮肤的真皮成纤维细胞进行原代培养细胞生长接近汇合时，换无血清培养基继续培养加入外源性TGF-1激活信号传导通路抽提总RNA抽提总蛋白RT-PCR检测TGF-1作用前后信号传导通路中各因子转录水平的变化：TR 1 /TR2 SMAD3/ SMAD7Westenblot分别检测TGF-1作用前后TR1/TR2/SMAD3/ PSMAD3/SMAD7的蛋白表达c实验结果分析,初步验证负反馈环路受阻和SMAD3持久磷酸化的推论。5a第二部分、负反馈环路受阻的机制a不同成纤维细胞中，不同剂量的TGF-1作用不同时间后，SMAD3和SMAD7表达水平变化。瘢痕疙瘩、正常瘢痕、正常皮肤的真皮成纤维细胞5pM、50pM、500pM的TGF-1刺激30分钟、1、2、4、24、48小时后分别抽提总蛋白、总RNAWesternblot检测SMAD3/SMAD7RT-PCR检测SMAD3/SMAD7b证实是否启动子区突变导致TGF-1对SMAD3表达的下调或对SMAD7表达的上调效应被阻断，或SMAD7编码区基因突变导致功能改变。瘢痕疙瘩和正常组织DNA提取设计SMAD3/SMAD7基因启动子区及SMAD7各外显子引物PCR电泳、SSCP分析回收泳动变异片断，再次PCR扩增DNA循环测序进行突变分析分析启动子区的突变对报告基因转录的影响及功能域突变对SMAD7功能的影响5b第三部分、SMAD3持续磷酸化的机制a阻断上游信号后，研究SMAD3是否持续磷酸化。原代培养的瘢痕疙瘩、正常瘢痕和正常皮肤的成纤维细胞装载SMAD7质粒的腺病毒表达载体转化，形成过表达的SMAD7，阻断I型受体对SMAD3的激活抗TR1抗体阻断TGF-1对受体的激活Westenblot检测 SMAD3PSMAD3免疫荧光法检测SMADs在核内和胞质内的分布抽提总RNART-PCR检测：SMAD3b证实TGF-1持续刺激是否导致SMAD3持续磷酸化。瘢痕疙瘩患者病损周边正常皮肤和非瘢痕疙瘩患者的正常皮肤成纤维细胞每日以5pM、50pM、500pM的TGF-1刺激5、10、20、30天后,换无血清培养基1天后，以抗TR1抗体阻断上游信号Westenblot检测 SMAD3PSMAD3免疫荧光法检测SMADs在核内和胞质内的分布5cc验证SMAD3是否有导致其稳定性增高的突变:单链构象多态性及突变分析研究瘢痕疙瘩和正常组织的SMAD3外显子。不同组织DNA提取设计SMAD3各外显子引物不同基因片断PCR扩增电泳、SSCP分析回收泳动变异片断，再次PCR扩增DNA循环测序进行突变分析分析该突变是否导致SMAD3的稳定性增高5d2.2可行性分析1） 可顺利获得瘢痕疙瘩、正常瘢痕、正常皮肤组织标本；2） 申请者掌握细胞生物学和分子生物学技术，操作熟练；3） 研究涉及的免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、以及PCR-SSCP技术已成熟；4） 研究所需的各种抗体均可购得，已获得包含SMAD7的腺病毒载体；5） 申请者具有一定基础及临床研究的经验，其所在单位对瘢痕形成调控机制的定量病理和动物模型，瘢痕胶原COL1A2基因转录调控，特异抑制TIMP-1基因表达促进瘢痕胶原降解等研究均取得成功，建立了瘢痕成纤维细胞三维培养体系，对瘢痕成纤维细胞中信号调控机制的研究形成了一套成熟有效的研究方法。6） 与美国加利福尼亚大学医学实验中心有良好协作关系，信息来源快，便于学术交流，有助于课题的完成。3. 本项目的创新之处1） 提出瘢痕疙瘩成纤维细胞中TGF-1/SMADs信号传导通路失调控的假说，研究其在瘢痕疙瘩发病机理中的作用，国内外均未见报道。2） 提出瘢痕疙瘩成纤维细胞中负反馈环路被抑制或阻断，导致正反馈环路持续放大的设想，并提出其发生的机制可能是SMAD3/SMAD7启动子突变或SMAD7编码区突变导致，并通过实验进行验证，国内外均未见报道。 3） 提出瘢痕疙瘩成纤维细胞中SMAD3在信号终止后持久磷酸化并在核内积聚的设想，并提出其机制可能是持续高水平的TGF-1刺激、受体敏感性增高导致或SMAD3编码区基因突变导致其磷酸化状态的稳定性增高，并通过实验进行验证。国内外均未见报道。5e4. 年度研究计划及预测进展2003.1-2003.6 瘢痕疙瘩组织及其成纤维细胞TGF-1/SMADs传导通路的对照研究，初步阐明传导通路失调控的机制。20XX.7-20XX.9 不同剂量的TGF-1作用不同时间后，RT-PCR和westernblot检测SMAD3和SMAD7的表达变化，验证负反馈环路受阻机制。20XX.10-20XX.3 用抗TR1抗体及装载SMAD7质粒的腺病毒表达载体阻断SMAD3上游的信号后，研究SMAD3是否仍持续磷酸化。20XX.4-20XX.6 大剂量的持续不同时间的外源性TGF-1刺激，证实TGF-1持续刺激是否导致SMAD3持续磷酸化。20XX.7-20XX.6 单核苷酸多态性分析,基因突变及功能分析。20XX.7-20XX.12 补充实验资料、总结、分析实验结果。5. 预期研究成果1) 在蛋白水平和基因水平对瘢痕疙瘩TGF-1/SMADs传导通路进行研究，阐明瘢痕疙瘩发病过程中，TGF-1/SMADs传导通路的失调控的机理。2) 验证SMAD3/SMAD7负反馈环路被阻断和SMAD3持续磷酸化而导致TGF-1信号持续放大的假设，从分析上游传导通路异常和SMAD基因突变进一步寻找其原因。3) 阐明这种失调控对瘢痕疙瘩的发生发展所起的作用。研究成果以论著形势上报，预计完成高质量56篇。6 四、研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩1）我单位是国内开展创伤修复与瘢痕形成机理等研究较早的单位，迄今为止，已承担这一领域国家自然科学基金及上海市科技发展基金10余项，涉及瘢痕形成调控的机制和动物模型，瘢痕胶原基因转录调控，病理性瘢痕TIMP-1基因表达调控，胎儿无瘢痕愈合机制，细胞外基质和细胞因子对成纤维细胞的调控等，圆满完成了有关研究工作。建立了瘢痕成纤维细胞三维培养体系，对瘢痕成纤维细胞中信号调控机制的研究形成了一套成熟有效的研究方法。2）本项目组的主要成员分别参加了“瘢痕胶原COL1A2基因转录调控的实验研究”， “特异抑制TIMP-1基因表达促进瘢痕胶原降解的实验研究”等多项国家自然基金资助的课题，熟练掌握了原代培养、免疫组织化学法、免疫荧光法、westernblot、RT-PCR、PCR-SSCP、细胞转染等技术。3）在胶原基因的转录调控研究中，已发现在TGF-1水平极低的情况下，瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞仍保持较旺盛的生长和较高水平的胶原基因的转录，提示细胞外基质合成分泌、细胞生长对TGF-1信号的失调控。有关成果待发表。2. 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况）申请者所在单位有分子生物学部门开放实验室，该实验室具备有层流室供细胞培养，核酸提取分离，并具备完整的免疫组化试验、PCR、RT-PCR、单链多态性分析以及目的基因表达产物测定等所需的配套仪器，具备较好的实验基础。基本具备实验所需的各种条件，可以满足实验需要。7* ：作者题目刊名年份卷（期）页码 专著：作者书名出版者年份8b 五、经费预算支 出 科 目金 额（万元）计 算 根 据 及 理 由1.合 计25.02.科研业务费2.00参加各种学术会议，查询文献资料，购买办公用品，材料打印，文章发表及评审费等。3.实验材料费17.002.0细胞培养试剂、血清 1.0重组TGF-1、各种酶、标准物及生物学试剂2.53.0免疫组化、免疫荧光试剂盒及检测4.0Westernblot 及各种抗体 2.0核酸抽提、PCR、RT-PCR 3.0SSCP、基因突变及功能分析1.0测序1.0消耗性实验用品4.实验室改造费3.00大型仪器维护费5.协作费2.00科研协作，国内外学术交流6.管理费1.00科研管理、水电费注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费 2. 实验材料费 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费5. 协作费 6. 项目组织实施费。开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。9 六、申请者正在承担的其它研究项目 （攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况）无七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况39870761瘢痕胶原COLIA2基因转录调控的实验研究1999.1至20XX.12参 加已结题10 对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况，后继研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（300字）及已发表主要相关首页复印件（限三篇）。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申请者（签章） 20XX年 3 月 10 日11 九、推荐意见 既不具有高级专业技术职务又不具有博士学位的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。项目组成员不能做推荐者。具有高级专业技术职务的在职博士生申请须由导师在此栏目签署意见。瘢痕疙瘩是整形外科领域中的一大难题，临床上对其造成的外形破坏和功能障碍尚无令人满意的治疗方法。其形成机制的研究涉及遗传、免疫、凋亡、成纤维细胞表型、细胞外基质代谢和细胞因子等多个方面，而几乎每一方面的研究都涉及信号传导。该项目应用细胞生物学和分子生物学的常规技术分析瘢痕疙瘩和正常组织成纤维细胞的TGF-1/SMADs信号传导通路中蛋白和基因水平的差异，阐述其失调控的机理，验证SMAD3/SMAD7表达失调导致负反馈环路受阻和SMAD3持续磷酸化的假说，通过基因突变分析等寻找其原因。有望揭示瘢痕疙瘩的形成机制，并为纤维化疾病中TGF-1信号传导的研究提供重要的理论依据。申请者是一位知识面广，基础扎实的整形外科医师，学术思想活跃，学科前沿动态掌握较好，有独立开展课题的能力，