氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞.doc

2010/11/07氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl法。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70保存。本实验以E.coli DH5菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基 ，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。二、设备 移液枪(20l,200l,1000l)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5l，比对PH试纸至PH7.0左右。1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。2) 分装3支3ml的液体培养基。3) 其余200ml用于制备LB固体培养基：分装3个50ml，分别加入0.75g细菌培养用琼脂。4) 高压后降温至65，制备2块氨苄抗性LB固体培养基（加48l氨苄抗生素），2块卡纳抗性LB固体培养基（加200l卡纳抗生素），2块无抗性LB固体培养基。2. 将准备好的LB培养基，甘油，2个50ml离心管，80个1.5ml离心管，高压。3. Tris-CaCl2 500ml（75mmol/L CaCl2，10mmol/LTris.Cl，pH6.5）：称取CaCl24.1621g，Tris0.6057g，先在烧杯中加约200ml的ddH2O用磁力搅拌器混匀，然后再加ddH2O定容至500ml，用盐酸调至pH6.5,最后再将配制好的Tris-CaCl2吸入30ml注射器中并经0.45um针头滤器过滤，方可得到最终的Tris-CaCl2500ml（75mmol/L CaCl2，10mmol/LTris.Cl，pH6.5）溶液。4. 卡那霉素：10mg/ml溶于水，工作浓度50g/ml，3ml菌液加大约15l卡那（1ml菌液加大约5l卡那），以水为溶剂的抗生素储存液应用0.22m滤器过滤除菌。5. 氨苄青霉素：50mg/ml溶于水，工作浓度60g/ml,3ml菌液加大约4lAmp（1ml菌液加大约1.2lAmp）。四、操作步骤1.受体菌培养：1) 无菌接种环刮取冻存于-70的大肠杆菌菌种DH5，划线接种于不含抗生素的LB固体培养基上，37培养16h左右。2) 挑取一单个菌落，接种于3ml 不含抗生素的LB液体培养基中，37下振荡培养过夜。2感受态细胞制备（CaCl2法）：准备冰浴，预冷的Tris-CaCl2和50ml离心管，甘油，80个封口膜，80个离心管1) 吸取2ml菌液接种于37预热的100mlLB液体培养基中（1：50的比例），37振荡培养2.53h（后一个小时随时观察细菌生长情况）。2) 无菌条件下，将培养液转入2个无菌预冷的50ml离心管中（以下操作均需无菌且在冰浴中进行），冰浴30min，冷却至0。3) 4，5000r/min离心10min。4) 弃上清，倒置离心管，使残留液体流尽，使细菌悬于10ml（每个管）预冷的Tris-CaCl2溶液中，冰浴15min。5) 4下，5000r/min 离心10min。6) 弃上清，每个管用2ml冰预冷的含15%甘油（300l）的Tris-CaCl2保存。7) 用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌离心管中，50l/每管，贮存于-70。3检测：准备冰浴，42水浴1) 将10l已有的分别含Amp，Kan的质粒转化到制得的感受态菌中。2) 冰浴30min，42水浴45s（1min），使其受热激，再冰浴1min30s(2min)。3) 加LB培养基940l，37摇床震荡培养1h。4) 12000r/min离心1min，弃大部分上清，留200l菌液，吹打混匀。5) 取100l菌液涂于培养皿上培养18h，观察结果。10