蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法.doc

专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 实验报告课程名称： 生物化学实验 指导老师： 成绩：_ 实验名称： 实验3 蔗糖酶蛋白含量的测定Folin-酚法 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填）七、讨论、心得一、 实验目的和要求1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；3、掌握分光光度计的使用方法。二、 实验内容和原理Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.050.5g/L.优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点： 该反应受多种因素的干扰。蛋白质(肽键) OH甲试剂 (酒石酸钾钠铜盐) 生成紫红色络合物 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸 紫红色络合物 OH 乙试剂 产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物） 三、 主要仪器设备1、实验材料： 蔗糖酶提取的各步分离纯化样品、。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。2、实验试剂： 标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 Folin-酚试剂 甲试剂 乙试剂装 订 线3、实验器材与仪器1、试管及试管架；2、可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；3、恒温水浴箱(25）。四、 操作方法和实验步骤1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线取6支试管，编号16，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（ A500nm值）。 表1试管号1234560.5g/L标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水 （ml）10.80.60.40.20Folin-酚试剂甲 （ml）555555混匀，在室温(25）下静置10 minFolin-酚试剂乙 （ml）0.50.50.50.50.50.5混匀，在室温下静置20minA500nm2、各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定 由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品、 的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。 取13支试管，编号113，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（ A500nm值）。表2样 品空白I(1:20 稀释)(1:15 稀释)(1:10 稀释)(原液)编 号12345678910111213样品液V(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5Folin酚甲试剂(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0混匀后，室温（25 ）放置10分钟Folin酚乙试剂(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混匀后，室温（25 ）放置20分钟A500nm3、绘制标准曲线并计算 绘制标准曲线： 以光吸收值（ A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。 计算： 蔗糖酶提取分离纯化的样品、 稀释溶液的光吸收值（ A500nm），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品、 溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。五、 实验数据记录和处理表1数据试管号123456A500nm0.0000.1170.2420.3300.4470.558蛋白质浓度（g/L）00.01540.03080.04620.06150.0769表2数据(蛋白质浓度根据x = ( y - 0.0059 ) / 7.187*6.5/V得出)样 品空白I(1:20 稀释)(1:15 稀释)(1:10 稀释)(原液)编 号12345678910111213样品液V(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5A500nm0.000 0.130 0.540 0.911 0.069 0.243 0.538 0.090 0.379 0.717 0.107 0.396 0.686 蛋白质浓度（g/L）2.245 2.415 1.637 1.141 1.072 0.962 1.521 1.687 1.286 1.829 1.764 1.230 蛋白质含量（平均值）2.099 1.059 1.498 1.608 最终蛋白质含量（g/L）41.9815.88514.981.608六、 实验结果与分析1. 吸光度蛋白质浓度标准曲线 数据的连续性较理想；2. 根据计算结果可知，随着纯化程度提高，提取液的蛋白质浓度未必升高，正常情况下必定升高的应该是产品的比活力。3. 该试验的结果是蔗糖酶活力测定实验的前提。七、 讨论、心得注意事项1.加入Folin-酚乙试剂后，要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。2.利用标准曲线测定未知样品的蛋白浓度时要考虑其适用范围，超出其范围的就不能根据标准曲线来求蛋白浓度。3.在使用分