LAMP检测综述-戴婷婷.doc

环介导等温扩增技术的应用研究进展戴婷婷1，陆辰晨2，郑小波2（1南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏南京210037；2南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095；）摘要：环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件（6065）下60 min左右进行核酸扩增，其扩增效率可达到1091010个数量级，具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点，已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原物的检测中。本文对LAMP技术原理及其在病原物检测中的应用做了简要综述。关键词： 环介导等温扩增技术；应用；检测；病原物中图分类号： 文献标志码： 文章编号：Application Research Progress Of Loop-Mediated Isothermal AmplificationDAI Ting-ting1; LU Chen-chen2; ZHENG Xiao-bo2(1Southern China Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry, College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China；2College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract：A new method of gene amplification called Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been developed in recent years. LAMP assay possess characteristic of simpleness, fleetness and high specificity. The whole procedure is very simple and rapid which can be completed in less than 80 min under isothermal conditions employing a set of six specially designed primers of a target gene, by incubating all the reagents in a single tube. LAMP does not require a thermal cycler and can be performed simply with a heating block or water bath. Considering the advantags of rapid amplication, simple operation and easy detection, LAMP has potential applications for diagnosis as well as surveillance of infectious diseases in developing countries without requiring sophisticated equipment or skilled personnel. LAMP has been widely applied to the detection of such pathogens as virus，bacteria, parasite, fungi etc. This article summarized the principle of LAMP，and the application in detection of pathogenic microorganisms.KEY WORDS：Loop-mediated isothermal amplification; application; detection; pathogenic microorganisms核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段，核酸扩增技术主要包括常规PCR 为基础的变温扩增技术以及等温扩增技术两大类。目前，变温扩增技术主要包括普通PCR、巢式PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等，这些技术在病原微生物的检测中发挥着重要的作用。由于核酸的变温扩增技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于在基层推广；而病原菌的防控关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。因此，建立一种快速、准确的新型的等温扩增技术对于植物病原物的检测显得尤为重要。等温扩增成为核酸扩增技术的一个研究热点，环介导等温扩增技术就是其中的一种。环介导等温扩增技术是日本学者Notomi1 等建立了一种新的核酸等温扩增技术。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测研究。随着该技术体系的完善与发展，其在分子检测领域的应用也必将越来越广泛与深入。本文就该技术的原理、方法及研究进展综述如下。1 环介导等温扩增技术简介1.1 LAMP技术特点及原理环介导等温扩增技术是Notomi1等报道的一种等温核酸扩增技术。该法依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的4条引物（2条外引物和2条内引物）和一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）。反应体系一般包括4条引物、Bst DNA聚合酶缓冲液、具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜碱、Mg2SO4等。LAMP检测体系中基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在3060min扩增1091010倍，特异性较高，同时反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁-乳白色沉淀。LAMP技术的主要原理是DNA在65左右可以处于动态平衡状态，DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环1。1.2 LAMP技术的引物设计LAMP技术对引物设计的要求非常高，LAMP的2 对引物分别称为 FIP、BIP、F3和B3，可识别靶基因的6个不同的区域。F3：正向外引物，F3区与靶基因的F3c区域互补；B3：反向外引物，B3区域与靶基因的B3c区域互补；FIP：正向内引物，由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5端的Flc区域序列相同；BIP：反向内引物，由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3端的B2c区域互补，B1c区域与靶基因5端Blc区域序列相同。内引物的两段DNA短片段可通过TTTT序列连接，也有研究结果认为在内部引物之间不加TTTT序列也并不影响等温扩增的结果，说明TTTT序列在内部引物上的连接上并不是必需的。Nagamine2等的研究发现在LAMP反应中加入环引物（正向环引物FLB、反向环引物BLP）能够明显加快等温扩增的速度，大大提高了检测效率，检测效率相对于没有加入环引物时高出7个数量级。LAMP技术的关键点是用于设计引物靶标基因的选择与引物的筛选。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间高度保守，而在种间变异性较高。选取靶基因一段约130200bp（最长300bp，不可超过500bp）的保守序列，同时要注重引物之间的距离、引物退火温度值的高低、引物长度和GC/AT含量等综合因素。整个LAMP扩增过程是等温的不需要变性的，为链置换和延伸的过程，因此扩增产物大小也随着链置换反应的进行而改变，从而在电泳图上表现为大小不一的阶梯状的条带。引物设计需要遵循以下原则：要保持引物的退火温度约5566间，其中F3和B3退火温度最低（5560间）；F2和B2的退火温度次之（5961间）；F1c和B1c的退火温度最高（6466间）。GC含量高者或者GC含量正常时，取退火温度范围的较高值；而AT含量高者取退火温度范围的较低值。F2的前端与F3及B2的前端与B3相距在020bp之间，F2的前端与F1c及B2的前端与B1c相距在4060bp之间，F2的前端与B2相距在120180bp之间。设计引物时要防止引物二聚体的产生，特别是引物的3端不应存在富AT区，不能与其它引物互补。引物设计可采用软件PrimerExplorer V4（/partner/lamp/index.html），并结合DNAstar的MegAlign模块和Primer Premier5进行引物设计与筛选。对于引物的特异性的验证可通过GenBank中的BLAST进行序列比对（/Blast.cgi），将设计好的4条引物分别在GenBank中的BLAST进行比对确认，同时设计的引物针对同种不同地域、寄主来源菌株、同属不同种的疫霉菌和其它真菌菌株进行特异性试验，从而保证LAMP引物的特异性。1.3 LAMP技术的检测方法1.3.1 肉眼观察法 在 LAMP 反应过程中，由于在反应过程中能够产生副产物焦磷酸镁白色沉淀，所以可以通过用肉眼直接进行观察来判断扩增反应是否进行（图1）。图1 LAMP反应的肉眼观察试验。左边-：无白色沉淀；右边+：白色沉淀Fig.1 Visual turbidity in the form of white precipitate as observed in positive control due to accumulation of magnesium pyrophosphate in proportion to the accumulated amplified products. Left, without template (-); right, with template DNA (+)1.3.2荧光检测法 通过肉眼直接观察白色沉淀来检测LAMP扩增反应的结果有时会存在一定的误差，所以可采用颜色变化目测的方式来判断检测结果，主要通过添加染料和金属离子指示剂来实现。目前使用的染料包括PicoGreen、SYBR Green I、钙黄绿素、羟基萘酚蓝（HNB）。其中以SYBR Green I和HNB的检测灵敏性最高，是钙黄绿素的10倍3。SYBR Green I在LAMP反应结束后加入，其LAMP反应溶液颜色在白光下由橙色变成黄绿色，在紫外光下阳性荧光量明显增强（图2），但由于SYBR Green I染料在反应结束开管后加入，反应产物形成的气溶胶可能会增加LAMP扩增产物的污染。相对于SYBR Green I染料，HNB于扩增反应前加入，减少LAMP反应的污染，其溶液颜色由紫色变为天蓝色（图3），阳性结果和阴性结果颜色差别明显，易于判断。图2 LAMP反应加入SYBR Green I显色反应试验。-：阴性反应；+：阳性反应Fig. 2 When the tube containing the amplified products incorporating a fluorescent intercalating dye is illuminated with a UV lamp, the fluorescence intensity increases图3 LAMP反应加入HNB显色反应试验。-：阴性反应呈现紫色；+：阳性反应呈现天蓝色Fig.3 When the tube containing the amplified products incorporating HNB is illuminated with naked eyes, the negative reaction remains purple and the positive reaction appears sky blue1.3.3 琼脂糖凝胶电泳法 LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP扩增产物在经过2%的琼脂糖凝胶糖和EB染色观察后呈现的是典型的梯型状条带（图4）。图4 2%琼脂糖电泳检测LAMP反应的灵敏度，以10倍递度稀释的大豆疫霉基因组DNA作为反应模板（从100 ng uL-1到10 fg uL-1）。LAMP反应灵敏度能达到10 pg L-1 (摘自Dai et al.,2012)Fig.4 Sensitivity of A3aPro-LAMP method using serially diluted genomic DNA (100 ng uL-1-10 fg uL-1) from P. sojae as template (from Dai et al., 2012)1.3.4 实时浊度仪检测 日本荣研株式会社利用LAMP反应过程中产生焦磷酸镁白色沉淀，专门研制出用于LAMP 检测的实时终点浊度仪LA-320C，以实现对LAMP扩增过程的实时监控，浊度仪通过每隔 6 s 测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应结果。Dai4等对大豆疫霉进行 LAMP 扩增，为了验证LAMP反应所设计的引物的种内通用性，采用疫霉菌的不同生理小种作为对照，并用以水作为阴性对照以检测LAMP反应的特异性。当发生 LAMP扩增反应, 产生大量的焦磷酸镁白色沉淀，反应液的浊度上升，在图中表现为曲线上升，大豆疫霉的生理小种都产生了浊度曲线，阴性对照的曲线均没有变化，表明设计的引物具有种特异性。1.4 LAMP技术的优缺点LAMP检测技术最主要的优势在于等温扩增条件下进行扩增反应，相对于普通PCR技术相比其有很多优点：（1）在等温条件下(60C-65C)就能进行扩增反应，反应时间短，仅需60min左右；（2）因没有变性的过程所以不需要热循环仪器，一个普通水浴锅或者等温保温瓶即可进行LAMP反应；（3）特异性较高，4条内外引物与靶序列的6个结合区完全匹配的情况下才能够进行LAMP扩增反应；（4）鉴定简便。但作为一项检测技术其不可能是完美的，LAMP检测技术也有些缺点归纳如下：（1）扩增片段过小，靶序列长度要控制在 300bp以下；（2）LAMP体系靶标选择和引物筛选较为繁琐；（3）LAMP反应体系容易产生非特异性条带的扩增；（4）操作时要求比较严格，气溶胶的污染容易导致结果的假阳性出现；（5）利用 LAMP技术的同一套特异性引物未必能检测具有单核苷酸差异的不同菌株型或同一株型的病原菌，对于单碱基核苷酸位点的鉴定适用性较差；（6）相对于Real-time PCR技术，LAMP反应体系不能对反应结果进行定量分析。 2 LAMP 技术在病原微生物检测中的应用2.1病毒的检测2.1.1 流感病毒的检测 流感病毒是引起人类流感的病原体之一，属于正黏病毒科，其分甲型、乙型和丙型流感病毒。流感病毒感染可导致一系列呼吸道疾病，临床症状从轻微的上呼吸道症状至急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭，甚至死亡。近年来已建立了针对季节性流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒LAMP技术。Poon5等建立了基于流感病毒基质蛋白基因的LAMP方法，可同时特异性检测季节性 H1、H2和H3亚型，其检测灵敏性也较高。聂凯6等针对人甲型H1N1流感病毒HA序列中8个基因区段设计了6条特异引物，在等温条件下进行核酸扩增反应1.5h，通过HNB的颜色变化做为结果判定标准并经琼脂糖凝胶电泳验证，建立了逆转录环介导等温核酸扩增技术应用于人甲型H1N1流感病毒的检测。Imai7等利用RT-LAMP技术建立了针对H5亚型高致病性禽流感病毒的检测方法，该方法简便快速、成本低、不需要特殊试剂，灵敏度比普通RT-PCR技术高100倍，而且可以从15个血凝素亚型HA中检测出H5亚型，具有很高的特异性，在对高致病性禽流感的病原监测应用中具有很高的实用价值。李启明8等建立了RT-LAMP检测技术用于H5N1亚型禽流感病毒的检测，该技术对51份感染标本的H5N1亚型的HA和NA基因区进行了RT-LAMP技术检测，并以SYBR Green作为反应指示剂，同时对反应进行实时浊度监控，证明RT-LAMP技术具有较高的特异性；灵敏结果也显示RT-LAMP技术与Real-time PCR技术灵敏度一致。2.1.2 SARS冠状病毒的检测 导致严重急性呼吸综合征（SARS）世界性爆发流行的病原体是一种新型的冠状病毒SARS冠状病毒（SARS-CoV），这是一种RNA单链正链病毒，可以导致人体以呼吸系统症状为主要表现的全身疾病。LAMP技术针对急性呼吸道综合征冠状病毒（SARS-冠状病毒）已经开发了检测试剂盒。Poon9等对检测试剂盒进行了临床实验的评估，评估结果显示LAMP技术在疾病发生的前三天检测料率稍逊于RT-PCR检测，但是LAMP技术的简单化、可视化、高灵敏度等优点使其具有临床诊断领域的潜在能力。Thai10等也报道了SARS冠状病毒的LAMP检测技术，其设计的LAMP特异性引物具有较好的特异性，同时灵敏度是普通RT-PCR灵敏度的100倍。2.1.3 猪类病毒的检测 Anne-Lie B11等应用RT-LAMP法可在30min60min检测出猪水疱病毒（SVDV），通过对收集的28株SVDV检测呈阳性，而其它病毒仍然是阴性；同时利用血清学的临床样本进行灵敏度的实验，结果发现RT-LAMP检测法的灵敏度与Real-time PCR相同；利用粪便样本进行灵敏度的实验，结果发现RT-LAMP检测法的灵敏度比普通PCR技术更加灵敏。Chen12等基于猪细小病毒（PPV）非结构蛋白1的4条特异性引物建立了PPV的LAMP检测方法，实验证明LAMP是一种简便、敏感、快速、可靠的PPV检测方法。何逸民13等对LAMP反应体系和反应条件的优化，LAMP技术能在63、60 min内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因。Chen HT14等利用RT-LAMP技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），研究选用10个参考株、122个阳性标本和临床分离株进行了测试。结果表明这种检测技术较普通RT-PCR技术更可靠、更方便、更快速灵敏地诊断出高致病性PRRSV感染。除此之外，LAMP技术还成功应用于非洲猪瘟病毒（ASFV）15、猪瘟病毒（CSFV）16等猪类病毒。2.1.4 伪狂犬病毒的检测 伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒、呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染。伪狂犬病毒（PRV）是一种RNA弹状病毒，伪狂犬病的临床症状和呼吸、肠道疾病很类似，因此临床诊断伪狂犬病很困难。En F X17等建立了一种快速、简便和可靠的伪狂犬病毒（PRV）检测系统，针对PRV DNA结合蛋白基因利用RT-LAMP技术成功设计了特异性引物检测PRV。2.1.5 其它病毒的检测 口蹄疫病毒（FMDV）属于小RNA病毒科，单股正链RNA病毒。Dukes J P18等建立了检测FMDV的RT-LAMP方法，针对病毒的3D蛋白聚合酶区设计引物进行RT-LAMP反应，其能在22 min内检测出10个拷贝的FMDV。传染性造血器官坏死病毒（IHNV）是一种棒状RNA病毒，感染一些特异性的鱼种，侵染野生和饲养的蛙鱼时能够引起其大量死亡。Gunimaladevi等19利用RT-LAMP也建立了IHNV的快速检测体系，通过和巢式PCR技术进行灵敏度的比较，发现RT-LAMP检测技术的灵敏度是巢式PCR检测技术的10倍，并且操作简便、成本低，比其他分子检测方法更适合用于检测IHNV，对控制和防止鱼类传染病具有重要意义。此外，LAMP技术也成功应用于流行性乙型脑炎病毒20、对虾白斑综合征病毒21、牛病毒性腹泻病毒22、丙型肝炎病毒23、腮腺炎病毒24、新城疫病毒25等检测中。2.2 细菌的检测2.2.1 沙门菌属的检测 沙门菌属（Salmonella）广泛分布于自然界中，是包括人类在内的所有脊椎动物肠道中的常见寄生菌26。人只要经口摄入足够量的细菌克服胃酸等机体保护屏障，定位于小肠即能引起沙门氏菌感染性疾病；沙门菌亦被列入化妆品中微生物的控制指标。因此，沙门菌病的防治备受畜牧兽医、公共卫生和检验检疫等有关部门的关注，均将沙门菌列为重要的检测和控制对象。传统的检测方法是采用沙门氏菌的分离培养与鉴定，其使用的是肠道鉴别培养基或者选择性培养基的方法，传统分离方法所需时间较长，通常需要5-6天。用 PCR检测沙门菌需要设计特异性的引物，使用最多的引物则来源于沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA，通过普通PCR的快速检测，其具有较好的特异性与灵敏度，但PCR技术需要琼脂糖凝胶电泳和热循环仪器。Hara-Kudo27等采用LAMP检测技术建立了肠炎沙门氏菌的检测体系，同时比较了LAMP检测体系与普通PCR检测系的灵敏度，实验结果显示LAMP方法检测灵敏度与 PCR方法检测灵敏度相比有所提高，且具有良好的特异性。张宏伟28等针对沙门菌特异性基因invA，设计了4条沙门菌属的 LAMP 检测特异性引物，建立了食品中沙门菌的LAMP 检测方法；其建立的LAMP技术特异性好、灵敏度高、与传统方法相比可节省大量时间且对实验仪器和操作人员的要求低，非常适于在实际工作中推广。2.2.2 副溶血弧菌的快速检测 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是我国一种重要的食源性病原菌，可引起急性肠胃炎，少数情况还能引发败血病，危及生命。副溶血弧菌引发食物中毒的规模呈明显的上升趋势，目前已超过沙门氏菌食物中毒，跃居首位。因此需要从多方面加强检测，以防止该菌对食品造成的大面积污染,保证人的身体健康。传统鉴定副溶血性弧菌的方法是分离培养、镜检、观察、生化鉴定等，这些检测手段不仅需要专业技术人员，同时鉴定过程耗时、灵敏度低、操作复杂；随着核酸分子检测技术的不断的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测副溶血性弧菌29-31，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长需要45 h，不能满足快速检测的需求；同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。目前针对副溶血弧菌的环介导等温扩增检测技术的国内外的报道是非常多的，足以证明这一技术在副溶血弧菌的检测中起到非常重要的作用。王虹玲32等以副溶血弧菌具有种特异性的gyrB基因为靶基因设计了LAMP引物，建立了环介导等温扩增方法检测贝肉中的副溶血弧菌，结果表明LAMP体系具有很高的特异性和敏感性；应用于61份贝类海产品的现场检测，阳性率为100%，与实时荧光定量PCR方法的检测结果相符，阳性率高于传统的培养鉴定方法。徐芊33等针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）设计4条特异性引物（两条内引物和两条外引物）建立了LAMP扩增技术。刘威34等也针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计并筛选出了4条特异性的LAMP引物，通过识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌，具有较好的特异性，且LAMP检测法灵敏度是普通PCR法的10倍。LAMP 方法用于快速检测副溶血性弧菌检测过程简单、特异性强、灵敏度高、鉴定方便，所以LAMP法检测副溶血性弧菌特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断。2.2.3 志贺菌属的检测 志贺菌属（Shigella）的细菌是最为常见的导致细菌性痢疾的病原菌，是引起食物中毒的常见致病菌之一，引起食物中毒的食品多为肉类、乳制品等蛋白质含量较多的食物。与沙门菌属和副溶血弧菌相同，最初也采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间长，通常需要35 d。随着检测技术的不断发展，志贺菌属也建立了环介导等温扩增技术。易海华35等基于志贺菌侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）的保守序列设计并筛选出1套LAMP引物，对21株志贺菌和非志贺菌进行特异性检测以确定其特异性，并使用LAMP和普通PCR技术对ipaH基因重组质粒倍比稀释液进行检测以确定其灵敏度，结果显示LAMP技术可以在1 h内完成扩增技术，特异性也较好，灵敏度是普通PCR的10倍以上。2.2.4 分支杆菌属的检测 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。其可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。结核分支杆菌生长比较缓慢，所以临床上一直在寻找快速准确的鉴别方法诊断分支杆菌。Iwamodo36等根据16S核糖体DNA保守序列和gyrB基因序列设计了LAMP反应的特异性的引物，采用LAMP体系成功的从痰标本中鉴定出结核分支杆菌、禽分支杆菌和胞内分支杆菌。黄帆37等也以结核分支杆菌作为研究对象，设计了4种LAMP引物以特异地识别结核分支杆菌中gyrB基因的六个特殊区域，通过LAMP检测技术可以在几种常见的致病分支杆菌中能快速、特异地检测出结核分支杆菌。2.2.5 大肠杆菌O157：H7的检测 大肠杆菌O157：H7是肠出血型大肠杆菌（enterohemorrhagic E.coli, EHEC）的一个主要血清型，是最为常见的食源性致病菌，被污染的食品是其主要的传染源，而猪、鸡、牛、羊等家禽是次要的传染源。Maruyama38等将LAMP技术和原位杂交技术相结合，用于检测携带stx2基因的大肠埃希菌O157:H7。易海华39等利用LAMP核酸扩增基因技术针对编码O157:H7脂多糖的rfbE基因和编码H7鞭毛抗原的fliC基因设计了LAMP检测的特异性引物。2.2.6 其它细菌的检测 LAMP 技术还成功用于特异性的检测单增李斯特菌的肌动蛋白诱导蛋白聚集因子基因（actA）和空肠弯曲茵的促旋酶基因（gyrA）、超级细菌的-内酰胺酶-新德里金属-内酰胺酶-1基因（NDM-1）、肺炎链球菌的lytA基因（lytA）、假结核耶尔森菌基因（inv）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因（mecA）和特异性基因（femA）基因以及小肠结肠炎耶尔森氏菌、创伤弧菌等40-43细菌病原物。2.3 寄生虫的检测非洲锥虫病（African Trypanosomiasis）亦称睡眠病，系由罗得西亚锥虫或冈比亚锥虫所致的中枢神经系统感染性疾病，借舌蝇传播，流行于非洲南北纬20之间。早期临床表现为长期不规则发热，全身淋巴结肿大、皮疹、晚期以神经系统症状为主，有严重头痛、肌肉震颤、反应迟钝、昏睡以至昏迷死亡。Kuboki44等采用LAMP法建立了非洲锥虫病的检测技术。尾蚴是日本血吸虫的感染期，因此检测水体尾蚴的有无可为安全用水提供好的依据，杨秋林45等采用LAMP法建立一种检测日本血吸虫尾蚴的方法；LAMP检测尾蚴电泳后阳性呈典型的特征性梯状条带，其灵敏度能达到1条尾蚴。2.4 菌物的检测LAMP已广泛应用于对病毒、细菌及寄生虫这些病原微生物的检疫检测中，但是对菌物检测的研究相对较少。已有多篇论文发表证明LAMP同样适用于病原菌物的检测中。南美芽生菌病由巴西类球孢子菌引起的皮肤黏膜、淋巴结和内脏器官的真菌性疾病，高发于拉丁美洲国家，而在非流行地区，南美芽生菌病的诊断是比较困难。传统检测需经过真菌培养才能确诊；采用PCR技术从真菌细胞内检测出巴西类球孢子菌的特异性基因gp43和gp27需要56 h，如果是血液或组织标本则需要12 h以上才能检测出来；Endo46等和Tatibana47等用 LAMP 检测gp43基因只需要3h即可特异性的检出巴西类球孢子菌。Lucas48等基于CAP59靶标序列建立了隐球菌的LAMP 检测技术，用于鉴定隐球菌复合种的不同血清分型。大豆枯萎病又称萎蔫病、黄叶病、根腐病，是一种分布较广、危害较重、防治困难的世界性土传病害。近年来，随着大豆种植面积不断扩大，大豆枯萎病的发生呈扩大蔓延、加重危害的趋势，对大豆生产造成很大威胁。为了阻止大豆枯萎病传播范围的不断扩大，使大豆枯萎病得到控制；Lu49等分析了大豆尖镰孢CYP51C基因和其他镰孢菌在序列上的差异，设计了四条特异性的LAMP引物和两条环引物，在此基础上建立了检测大豆尖镰孢的LAMP体系。Niessen50等基于半乳糖氧化酶基因（gaoA）建立了禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的LAMP检测体系；同时Abd-Elsalam51等采用Niessen建立的LAMP检测体系将其应用中谷物类感染镰刀菌的检测，从而为镰刀菌的检测提供了采用快速、灵敏的检测方法。Duan52-53等将LAMP 检测技术应用于禾谷镰刀菌2-微管蛋白的点突变检测中，同时还建立了葡萄灰霉菌（Botry cinerea）的快速LAMP检测技术体系。Ohori54等建立了奔马赭霉菌（Ochroconis gallopava）的LAMP检测方法，有助于肺部暗色丝孢霉病的诊断。Sun55等也建立了马尔尼菲青霉病菌（penicillium marneffei）的LAMP检测技术。在卵菌的应用中，Dai4等分析了大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）和其他疫霉菌在A3aPro序列上的差异，设计了LAMP的特异性引物，在此基础上建立了检测大豆疫霉菌的LAMP体系，结果表明整个检测过程仅需 1 h，即可通过肉眼直接目测实验结果，同时，Dai56等应用环介导等温核酸扩增技术建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌的检测方法。因此，LAMP 在菌物检测中具有代替传统 PCR的潜能。3 展望LAMP技术作为一种等温核酸扩增技术，其优点在于反应速度快、特异性高、设备简单、结果易于鉴定，适用于基层检验检疫机构和医疗机构。目前，已有几十种LAMP试剂盒已经国产化和商业化，检测成本大大降低，促进了 LAMP 技术的推广和普及。但在病原菌的检测中的应用还是非常有限的，常规的LAMP技术只能检测1-2种病原菌。随着生物技术的不断发展，近年来新发展起来的LAMP与芯片的整合技术，如L-LAMP、mL-LAMP技术等可以实现同时检测多个基因、多个样本，实现病原菌高通量的检测，在基层实验室和口岸检疫等具有广阔的应用前景。参考文献References：1 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. 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