基因芯片在植物研究中的应用.doc

基因芯片技术及其在植物研究中的应用 郭晓琴 中州大学，河南 郑州 450044摘要：基因芯片是以预先设计的方式把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵。具有高通量、微型化、自动化、快速、准确等优点。基因芯片技术在植物的病原体检测、抗逆性基因表达、转基因的检测、新基因发现、突变基因筛查等方面有广泛的应用。本文简述了基因芯片的原理、技术特点及其在植物研究方面的应用。关键词：基因芯片；植物；病原物检测；逆境Gene Chip Technology and Its Application in Plant Research Guo Xiao-qin Zhongzhou University， Zhengzhou 450044，ChinaAbstrat：Gene chips are pre-designed amounts of DNA probes or gene fragment in a specific arrangement which is fixed to the silicon, glass, plastic or nylon film carrier. With a high-throughput, miniaturization, automation, fast, and accurate. Gene chip technology play a important role in plant pathogen detection, resistance gene expression, transgene detection, discovery of new genes, mutation screening, etc. This paper introduces the principle of gene chips, the main technical features and its application in plant research.Keywords：gene chip; plant; pathogen detection; stress基因芯片技术是随着人类基因组计划的开展而发展起来的多种学科交叉渗透的高新生物技术。自1996年美国生物技术公司Affvmetrix制造了世界上第一个商业化基因芯片(Gene chips)起，基因芯片的研究和开发进入跨越式发展1。因为基因芯片技术用于基因分析的卓越优势，已广泛应用于生命科学各个领域，如用于检测基因表达，DNA测序，突变检测，基因筛查，新基因的发现等2。本文简要综述基因芯片的原理、技术特点以及基因芯片技术在植物研究中的作用。1 基因芯片技术的原理及特点基因芯片又称DNA芯片(DNA chips)，是生物芯片(bio-chip)的一种，是综合应用微电子学、物理学、化学、生物学和其他高新技术，把大量DNA片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA分子点阵。因其固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片3。基因芯片技术使得我们能够在全基因组水平上对基因的结构及其表达调控等问题进行研究，因此基因芯片也被誉为“缩微实验室”( Lab- on- a- Chip) 。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术（DNA blotting hybridization），即将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，将分析样品标记后，与固定在芯片上的探针杂交。其技术程序一般主要包括芯片制备、待测样品的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等4。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有诸多优点，如可信度高、信息量大、操作简单、重复性好、可重复使用等3-5。2. 基因芯片在植物研究中的应用2.1 在植物病原体检测中的应用Lee等设计了一种芯片，可以检测和区别4种感染葫芦科植物的烟草花叶病毒组成员6。Abdullah等应用该技术成功检测了马铃薯A病毒(PVA)等12种病毒7，马新颖等建立了黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、木槿褪绿环斑病毒等10种植物病毒的基因芯片检测方法8。陈昱等结合RT-PCR，制备了用于检测CMV、TMV和PVY 3种病毒的基因芯片9。龙海等结合双重PCR和基因芯片技术，以铁载体受体(Putative siderophore receptor)基因序列和RNA多聚酶西格玛因子(RNA polymerase sigma factor, rpoD)基因序列为靶标，设计引物和特异性探针，同时检测和鉴定水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌等4种病菌，对这4种致病菌基因组DNA的检测灵敏度约为3 pg10。罗焕亮等通过分析比对11种检疫性植原体的16S rDNA序列，设计了通用引物以及种间特异性探针，并建立了植原体基因芯片检测技术，实现了高通量检测植原体病原，提升了检疫鉴定植原体的速度11。2.2 研究植物的逆境基因表达近年来，阐明植物逆境胁迫下的分子机制成为研究的热点，基因芯片技术也已成为重要的研究手段。Dhanaraj等采用cDNA微阵列分析了蓝莓(Vaccinium section Cyanococcus)在大田和室内的耐低温胁迫研究发现，上调表达的基因在冷室中要比大田的要多，有些基因仅在室内被诱导表达，比如与抗胁迫相关的基因，一些编码糖酵解和TCA循环的酶类和一些与蛋白质合成相关的酶类12。Ozturk等利用cDNA微阵列研究了大麦干旱胁迫下基因表达情况，有15%的转录签受到干旱的诱导或抑制，上调表达的转录签中主要涉及到了茉莉酸合成相关基因、类金属硫蛋白、晚胚胎期丰富(late-embryogenesis-abundant, LEA)基因、ABA相关基因等13。Jiang等采用包含23 686个拟南芥基因的cDNA微阵列分析了盐胁迫处理6 h， 24 h，和48 h后根系的基因表达情况，分别检测到2,433和2,774个基因受盐胁迫的诱导和抑制14。2.3 转基因农产品检测寻找和搜集用于转基因技术的启动子、目的基因(如抗病基因、抗虫基因等)和标记基因的EST序列，制成基因芯片，可以对转基因农产品进行检测。周萍萍等根据大豆中所转入的外源基因，选择camv35S启动子、nos终止子和p4epsps基因，以大豆内源基因lectin基因为内参照基因设计了引物和探针，检测转基因含量不同的RRS标准参考物检测灵敏度均可达04515。Suzuki等使用寡聚核苷酸微阵列分析了携带35S：VP1的拟南芥转基因植株，并分析鉴定了353个VP1ABA调控的基因16。2.4 用于检测基因突变和多态性分析基因芯片可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变，还可研究基因( 组) 的多态性，将基因芯片技术用于检测分子突变，除可准确定位突变位点、确定突变类型外，更重要的是它的快速、高效性。将此技术应用在遗传育种上，大大降低了植物育种的难度和工作量。3展望为提高基因芯片分析的准确性，降低操作的复杂性，基因芯片发展方向至少应包括以下几个方面：（1）允许更长的寡核苷酸探针用于点阵芯片；（2）芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析趋向标准化；（3）设计新的更敏感的信号检测系统。最近几年，基因芯片技术有了很大的进展，目前该技术对样品的需要量非常少，效率高，能同时分析数千种作为遗传、基因组研究或诊断用的DNA序列，并且检测基因表达变化的灵敏度高，特别是在探明基因之间表达的相互关系方面具备无可比拟的优点。尽管基因芯片技术还存在很多问题，但由于其具有并行化和高通量的特点，它的应用前景仍十分广阔，如对基因功能、植物生理机制、食品卫生、环境污染监测的研究等方面。参考文献1熊伟基因芯片技术在生命科学研究中的应用进展及前景分析J生命科学仪器，2010，8(1):32-362Check Hayden EGene chips unmask cryptic diseasesJNature，2008，18;455(7211):274-2763 李克勤，宫奇琳，徐焕春，2004，生物芯片技术及应用J生物医学工程研究，23(10)：59-60.4吴明煜，郭晓红，王万贤，柯文山，杨毅，吴燕，2005，生物芯片研究现状及应用前景J，科学技术与工程，7(5)：3437.5王升启基因芯片技术及应用研究进展J生物工程进展，1999，19(4):45516Lee G P，Min B E，Kim C S，et alPlant virus cDNA chip hybridization for detection and differentiation of four cu-curbit-infecting TobamovirusesJJournal of Virological Methods，2003，110:19247Abdullahi I，Koerbler MThe 18S rDNA sequence of Synchytrium endobioticum and its utility in microarrays for the simultaneous detection of fungal and viral patho-gens of potatoJApplied Microbiology Biotechnology，2005，68:3683758马新颖，汪琳，任鲁风，等10种植物病毒的基因芯片检测技术研究J植物病理学报，2007，37(6):5615659 陈昱，潘迎捷，赵勇，等. 基因芯片技术检测3种食源性致病微生物方法的建立J.微生物学通报，2009， 36(2): 285-291.10龙海，李一农，李芳荣. 四种黄单胞菌的基因芯片检测方法的建立J. 生物技术通报,2011,1(1):186-190.11罗焕亮，张丽君，胡小华等.植原体检测基因芯片制备及其初步应用J.植物检疫，2011,25（1）：9-13.12Dhanaraj AL, Alkharouf NW, Beard HS, Chouikha IB, Matthews BF, Wei H, Arora R, Rowland LJ. Major differences observed in transcript profiles of blueberry during cold acclimation under field and cold room conditionsJ. Planta, 2007, 225(3): 735751.13Ozturk ZN, TalamelV, Deyholos M, Michalowski1 CB, Galbraith DW, Gozukirmizi N, Tuberosa R, Bohnert HJ. Monitoring large-scale changes in transcript abundance in drought- and salt-stressed barleyJ. Plant Mol Biol, 2002, 48(5-6): 551573.14Jiang YQ, Deyholos MK. Comprehensive transcriptional profiling of NaCl-stressed Arabidopsis roots reveals novel classes of responsive genesJ. BMC Plant Biol, 2006, 6: 25.15周