RT-PCR法检测TOCP染毒母鸡坐骨神经Caspase-3 mRNA 的表达.doc

RT-PCR法检测TOCP染毒母鸡坐骨神经Caspase-3 mRNA 的表达一、前言1.关于RT PCR:为逆转录PCR或反转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。在PCR中需要设计引物，引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物设计有其原则：（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计。（2）引物长度一般在1530碱基之间。（3）引物GC含量在40%60%间，Tm值最好近72。（4）引物3端要避开密码子的第3位。（5）引物3端不能选择A，最好选择T。（6） 碱基要随机分布。（7）引物自身及引物之间不应存在互补序列。（8） 5端和中间G值应相对较高3 端较低。（9）引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。（10） 扩增产物的单链不能形成二级结构。（11）引物应具有特异性。2.关于TOCP:磷酸三邻甲苯酯是有机磷化合物的一种，常用于塑料、树脂、橡胶、涂料及合成纤维等工业，作为增塑剂或溶剂，并用作汽油添加剂，能诱发人和敏感动物出现迟发性神经毒性常作为经典的迟发性神经病（OPIDN） 诱发剂。有研究发现TOCP染毒的成年罗曼母鸡出现迟发性神经病症状前，坐骨神经神经组织中已有Caspase-3含量的升高现象。3.关于Caspase-3: Caspase-3 是Caspase 家族的一员,是哺乳动物细胞凋亡的关键酶。Caspases家族是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中、结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。其最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。二、实验材料、仪器、试剂1、实验材料：TOCP 染毒成年罗曼母鸡；大肠杆菌工程菌JM109 由本研究室保存。 2、实验仪器：超净工作台、PCR仪，、电泳仪、电动匀浆器、超速离心机、EP管、微量移液器、LA平板、LB平板等3、实验试剂：TOCP、DEPC、RNA 酶抑制剂、M-MLV 反转录酶、克隆载体pMD18-T、rTaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 分子量标准、IPTG 和X-gal、Trizol 试剂、琼脂糖、DNA 回收纯化试剂盒、无离子水等三、实验步骤：1.实验动物的处理和样品采集：成年罗曼母鸡16只，随机分为阴性对照组和处理组，处理组一次性灌喂TOCP（750mg/kg），两组自由饮水、喂养2周后断颈放血处死，分别取坐骨神经，均迅速加于冰浴的DEPC 水中，用匀浆器匀浆，并参照Trizol Reagent 说明书进行RNA 的提取，以检测caspase-3 mRNA 表达量。2.引物设计与合成：根据GenBank 发表的caspase-3 基因序列（NM-204725）和-actin 基因序列（NM205518），应用Oligo6.0 软件设计引物，由北京英骏基因技术有限公司合成。经检验，引物内部无发卡结构，引物之间无二聚体形成，引物与基因库之间无非特异性同源区域。引物序列及目的基因长度见表1。3.神经组织RNA的提取与鉴定：按照Trizol 试剂的使用说明书操作提取坐骨神经总RNA，溶于DEPC水中，用紫外可见分光光度计进行质量鉴定。4.RT-PCR扩增目的基因：将提取的RNA 定量为10 g （20 L） RNA于EP 管中，加入下游引物，70 水浴5 min，冰盒冷却5 min， 依次加入5M-MLVRT 缓冲液、dNTP混合物、RNA 酶抑制剂、M-MLVRT，37 水浴90 min。以上述反转录产物作模板，依次加入灭菌去离子水、10Taq 缓冲液、dNTP 混合物（2.5 mmoL）、上、下游引物、Taq DNA 聚合酶， 进行PCR 反应，具体条件见表2。取扩增产物5L，于1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。5.鸡坐骨神经Caspase-3 mRNA表达的测定：将经胶回收试剂盒回收后的PCR 产物与pMD18-T 载体于16连接过夜，转化到JM109感受态细胞，涂于含有IPTG 和X-gal 的氨苄西林LB 平板，37培养1416 h，挑出白色阳性菌落接种于含氨苄西林液体LB 中，37振荡培养10 h，经快速提取法初步鉴定后，用小量质粒抽提试剂盒提取质粒， 进行酶切鉴定和PCR 鉴定。 四、预期结果：1、坐骨神经组织中总RNA提取样品的A260/A280 值在1.82.0，即RNA 纯度较高，经琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察，未见明显降解。2、目的基因经PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，在约282 bp（-