国产纳米微球胶乳颗粒将提高免疫检测试剂生产效率3-5倍.doc

国产纳米微球/胶乳颗粒将提高免疫检测试剂生产效率3-5倍 发布: 2010-08-19 来自: bio-equip 阅读数：2124次 /news/instrument/article/22303.html?comment=1国家生化工程技术中心(北京) 1.现代免疫检测的工作原理免疫检测是目前医疗卫生和生物科学研究领域常用的诊断方法。免疫检测的核心步骤为抗原-抗体间特异性的复合反应，通过复合反应产生检测信号，实现对溶液中抗体或抗原性的定量。由于抗体分子能够识别非常有限的分子种类，因此免疫检测能够获得极高的准确性。酶标抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。2. 纳米材料推动免疫诊断试剂盒的开发随着材料科学的进步，纳米人工材料开始进入免疫诊断试剂的开发领域。纳米材料，特别是纳米球形材料被广泛应用于抗体/抗原分子的负载，在众多复合反应过程中起到增强信号的作用。通过载体的放大，检测灵敏度可提高几个数量级，达到准确的定量效果。图 1. 纳米乳胶粒辅助的免疫检测；A：免疫比浊反应；B：免疫荧光检测；C：常规和纳米载体辅助的酶联免疫显色（HRP辣根过氧化物酶）A：免疫比浊检查，检测原理如图1A所示，免疫比浊试剂中抗体被固载于纳米颗粒表面，当抗体-抗原复合反应发生时，会造成纳米颗粒间聚集，通过分光光度计测量相应抗原/抗体添加前后液体浊度的变化。相比传统的分子间聚集，纳米乳胶的团聚体处于纳米尺度，会带来更明显的信号相应。B：免疫荧光检测，检测原理如图1B所示，使用亚微米尺度的载体辅助初级抗体，载体粒径为400-800nm，同样需要将抗体固载于载体球表面，抗体抓住抗原分子后，再与荧光标记的抗体结合，使载体具有稳定的荧光信号。使用透析法洗涤纳米载体，最后使用流式细胞仪进行检测。C：纳米球辅助的酶联显色反应（ELISA），检测原理如图1 C所示，使用小尺度载体，载体粒径为30-200nm，操作方法如常规ELISA操作，使用酶标仪进行读数。并考察纳米载体的引入对检测灵敏度的贡献。相比传统的复合反应过程，纳米载体能够引入更多酶分子（辣根过氧化物酶HRP），带来更显著的检测信号。3. 适用于抗原/抗体分子负载的纳米微载体图 2. 纳米载体的电子显微镜照片；A：放大1E4倍300纳米微载体，B：放大4E4倍160纳米微载体，C：放大4E4倍410纳米微载体图 3. 160纳米载体固载蛋白前后原子力显微镜照片；A：空白球原子力显微镜高度图，B：空白球原子力显微镜相位图，C：表面覆盖一层谷氨酸脱氢酶后相位图在获得相应抗体/抗原分子基础上，纳米支撑材料的性能成为开发新型免疫检测试剂的关键。为满足蛋白分子固定化的需要，国家生化工程技术研究中心(北京)经过多年研究,初步建立了纳米、亚微米聚合物微球的制备和纯化工艺。能够分别制备出50-800nm多种尺寸、多种表面基团的聚合物微载体，实现了克级的制备规模，部分产品图片如图2所示。相比市场上同类产品，我国自主开发的产品真正实现了“表面活性剂零残留”，在后期纯化过程中首次实现了“零絮凝”，达到了更高的质量标准。相比文献中报道的制备工艺，自主研发工艺将生产效率提高了3-5倍，并且更有利于实现规模化生产。在多种纳米球成功制备的基础上,中心的研究将多种纳米载体用于蛋白分子的固载。如图3所示，通过原子力显微镜表征，能够清楚的分辨出蛋白质分子固载前后，载体界面性能的变化。纳米载体与酶分子的结合方法如图4所示，使用水溶性碳二亚胺（EDC）活化纳米球表面的羧基，使其与蛋白表面氨基形成酰胺键。该交联方法条件温和，有利于蛋白分子的活性保持。但羧基载体难以固定等电点较低的蛋白分子，在反应条件下，低等电点蛋白分子与载体都带有负电荷，难以相互靠近。在羧基球的基础上，通过接枝带有伯氨基的分子，将羧基载体改性为氨基载体。用相似的方法，活化蛋白分子上的羧基，再同载体表面氨基形成酰胺键，或使用氨基间交联的方式，实现抗体/抗原分子的固定。图4. 纳米载体与抗体分子偶联的示意图；A：羧基载体的交联途径；B：氨基载体的交联途径许多免疫制剂公司已经开始采用纳米微球来提高自己产品的质量，但国外的纳米微球价格昂贵，无形中大大提高了试剂盒的生产成本。而随着国家对生物材料研究的重视和投入,我国自主开发的纳米微球不仅成本较低，而且在质量上实现了“表面活性剂零残留”，在后期纯化过程中首次实现了“零絮凝”，达到了更高的质量标准。相比文献中报道的制备工艺，自主研发工艺将生产效率提高了3-5倍，并且更有利于实现规模化生产。如果在广大的试剂盒生产厂家和公司得到广大应用，无疑会引发试剂盒生产领域的新革命。同时对于