液态芯片技术.docx

液态芯片技术 首都医科大学附属北京天坛医院 张国军 1991 年 Foder 等人在 Science 杂志上首次提出生物芯片的概念。 1995 年， Schena 等在 Science 上报道， 45 个拟南芥基因固定在一张玻片上检测表达，这是第一次生物芯片真正意义上应用。 1998 年 , 美国科学促进会将生物芯片技术评为十大科技突破之一。 一、生物芯片的定义和分类 生物芯片是指能快速并行处理多个生物样品并对其所包含的各种生物信息进行解析的微型器件，它的加工运用了微电子工业中十分成熟的光刻技术和微机电系统加工中所采用的各种方法，只是由于其所处理和分析的对象是生物样品，故称之为生物芯片。生物芯片能对小分子、生物大分子、细胞、组织和微小生物等进行高通量快速、并行处理和分析。 根据结构，生物芯片可分为由生物材料微阵列构成的芯片和以各种微结构为基础的微流控芯片。生物材料微阵列构成的芯片包括 DNA 芯片、蛋白质芯片、组织芯片等，其工作原理是抗原抗体结合、核酸分子的碱基配对的作用，因此也为亲和生物芯片；以各种微结构为基础的微流控芯片包括毛细管电泳芯片、 PCR 的反应芯片、介电电泳芯片等。 二、生物芯片概况 电子芯片和生物芯片被称为 20 世纪最伟大的两个发现。生物芯片是分子生物学和信息学的结晶。根据其基材的不同大致可分为玻璃片芯片、膜基芯片、硅基芯片、光纤芯片等。它们的共同的特点是在固态基材上极小的面积里合成或固定上许多核酸或蛋白探针，使芯片上的每个或几个点代表一个基因或蛋白。利用生物芯片，科学家们可以通过一个实验对成千上万的基因或蛋白指标进行分析。生物芯片已成为生命科学领域中非常重要的手段。但遗憾的是，这些芯片的致命弱点就是其信息质量的稳定性和可重复性比较差，操作也较繁琐。正因为如此，芯片临床应用受到了很大的限制。 美国 Luminex 公司开发的液态芯片系统克服了这个缺点，成为正在崛起的一种标准化的新一代生物芯片技术平台，既能为后基因组时代的科学研究提供强大的技术支持，又能作为高通量的新一代分子诊断技术平台在临床分子诊断领域大显身手。 三、液态芯片简介 美国 Luminex 公司开发出的液态芯片技术平台是一种全新概念的生物芯片。该技术的核心是把微小的乳胶颗粒（ 5.6um ）用荧光染色的方法进行编码，每种颜色的微粒（或称为荧光编码微粒）代表一种检测标志物。应用时，把针对不同检测物的彩色编码微粒混合后再加入微量病人标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性地结合。最后用激光流式仪判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以一个微量液态反应体系中同时检测 100 个指标。 Luminex 公司称之为 “xMap” 技术。该仪器在我国 SFDA 进口注册时被称为 “ 多功能流式点阵仪 ” 。 液态芯片是真正的临床应用型芯片，是基因信息时代的生物精华。 （一）液态芯片的概念和特点：液态芯片技术是在有色微球、激光技术、应用流体学及高速数字信号处理技术的基础上发展起来的一种多功能的液相分析平台。 液态芯片技术平台应用非常广泛，编码微粒上可以包被蛋白也可以连接核酸，所以液态芯片既可以用来检测蛋白（蛋白芯片），也可以检测核酸变化（基因芯片）。 液态芯片的特点是高灵敏性，可以达到 0.01pg ；高通量，适应 96 孔板；高重复性， CV 值小于 5 ；操作简单。 （二）液态芯片的原理：如（ ppt13 ）图片所示，首先 把微小的乳胶颗粒（ Beads, 微球）分别染成不同的（多达 100 种）荧光色，然后把针对不同检测物的核酸（互补链）或蛋白（如抗原抗体）以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物（血清中的抗原、抗体、酶或 PCR 产物等），在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。检测时，微球成单列通过两束激光，一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性（定性）；另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量（定量）。所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。 液态芯片技术原理的核心：在聚苯乙烯微球内部通过使用 2 种荧光配比染色的方法可以进行 100 余种编码组合；每种荧光编码微球分别共价包被特异的基因探针或抗体、抗原、蛋白探针来特异结合待测样本中的靶向分子反应体系中靶向分子同时被标记上相应的报告荧光；最后通过流式细胞技术分离悬浮反应体系中编码微球，并使得单个的编码微球依次通过测量区域；测量区域是激光和液流交汇之处，报告荧光物质和微球内的编码荧光物质分别受到定量激光激发和定性激光激发，激发后光信号转化为电信号；通过计算机的分析处理，确定微球结合的分析物的定性和定量信息。液态芯片的核心技术及其机理图如（ ppt16-25 ）图片所示。从而促进反应体系效率上来讲，液态芯片分子杂交或免疫反应在悬浮溶液中进行，编码微球的探针和靶向分子都在悬浮的三维体系中，故反应速度和反应效率得到最大程度上的提升。所用的时间缩短到半小时，灵敏度可达 0 01Pg 。在特异性方面，激光只分析微球一定半径内的信息，检测特异性强，背景低。可同时得到液体芯片检测技术平台的定性和定量指标而无交叉影响。此技术可开展不同类型的工作，如微生物鉴定、免疫分析、核酸序列研究、酶学分析、受体和配体识别分析等。与传统方法相比可极大的提高标本利用率，患者的 1 份标本可以被用来同时检测多达 100 种生理、病理指标。 （三）液态芯片的优点：液态芯片的独特设计使得它拥有常规的检测方法所不具备的特点。 1. 高效：因为许多颜色的乳胶颗粒可以放在同一个反应体系内，所以一次可同时检测多种（ 100 种）生理病理指标。这与传统逐个检测的方式效率有很大的不同。 2. 高敏感：每个乳胶微粒上都以共价结合的方式包被上许多抗原、抗体或核酸分子，因其参与反应的分子多，产生的信号就强。具 Qiagen 公司的报道，用该平台检测 IL 8 时，其灵敏度为 0.01pg ，达到了非常惊人的水平。 3. 快速：因为杂交或免疫反应在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短，杂交后常不用清洗就可以直接读数，所以检测效率大大高于固相杂交。所用时间从几小时缩短到十几分钟。 4. 重复性好：固相芯片不能很好地应用于临床诊断，其中一个重要的原因是其重复性差。这是固液杂交方式的芯片目前难以克服的技术障碍。但液态芯片杂交发生在均相的液体环境中，其结果稳定，重复性非常好。另外，每个指标在一个反应体系中有 1000 5000 颗相同的微粒。检测时，抽取其中的 100 500 颗读数，最终的数据是取其均值，这样已经把误差减到最小。相比固相芯片每个指标只有 1 2 个数据，其数据的可靠性就会差很多。 5. 唯一被 FDA 批准用于临床诊断的生物芯片：具不完全统计，目前已有 4 家美国公司基于液态芯片技术平台的产品获得 FDA 的批准用于临床诊断。他们分别是 ZeusScientific 公司开发的 AtheNAMulti-Lyte 芯片用于自身免疫病 9 种抗体检测， INOVA 公司开发的也是应用于自身免疫病检测的液态芯片， One Lamda 公司和 Lifecode 公司开发的 HLA 分型液态芯片 。 四、液态芯片的应用 在液态芯片平台上可以开发许多产品，根据检测机理的不同，可大致分成蛋白芯片和基因芯片两大类。蛋白芯片基于的原理是抗原抗体的特异性相互作用，它所检测的目标物是蛋白；基因芯片基于的原理是核酸分子杂交，它所检测的目标物是核酸。国外目前有 20 余家公司正在研究基于液态芯片技术的产品，涉及的领域主要有 过敏原的筛查、细胞因子的检测、肿瘤标志物的检测、感染性疾病的抗原或抗体的检测、心血管标志物的检测、组织分型以及激酶和磷酸化等。 （一）艾芯：其中 AFP 、 CEA 、 CA125 、 NSE 、 CYFRA211 、 FPSA 、 TPSA 、 FSCG 、 CA242 九个指标只需要 20ul 的血清一次就可以测定出。涵盖了中国人群高发肿瘤的 85% ，强调了对最高发肿瘤肺癌的指标选择。采用液态芯片技术，高效、准确，节约了 30% 以上的费用和 50% 以上的时间。艾芯多指标检测平台被国际上认可。剔除了铁蛋白、 HGH 等指标，新增最佳肺癌指标 cyfra21 1 ，肺癌的检出率从 50 提高到 90 以上。 （二）肺芯：肺癌为国内发病率最高的肿瘤。肺癌的辅助诊断 4 项组合 CEA 、 CA125 、 NSE 、 Cyfra21-1 为欧洲肿瘤标志物组织（ EGTM ）推荐的肺癌黄金组。其中 Cyfra21-1 是肺癌最佳指标，单指标检出率大于 65% ，联合检测检出率提高到 90% 以上。 （三）消芯：消化系统肿瘤占国内肿瘤发病率 50% 以上，针对肝癌、胆囊癌、胰腺癌、食道癌、胃结肠癌，最精选的 5 个指标为 CEA 、 CA125 、 AFP 、 CA242 、 Cyfra21-1 。其中 Cyfra21-1 也是食道癌最敏感指标； CEA 和 CA242 是目前为胃结肠癌的最佳指标组合；新一代的 CA242 比 CA199 在胰腺癌、胆囊癌和消化道癌中假阳性更少。消芯的应用，使消化系统肿瘤诊断的准确率从单指标的 30-80% 提高到联合检测的 75-95% 。 （四）妇芯：是针对卵巢癌、宫颈癌、绒毛膜癌、乳腺癌、恶性畸胎瘤等设计的一种液态芯片。包含的指标有 CEA 、 CA125 、 AFP 、 Cyfra21-1 和 Free-betaHCG 。其中 CA125 是卵巢癌最佳指标，检出率大于 75% ； AFP 是卵巢内胚窦瘤最好指标。 Cyfra21-1 在宫颈癌的检测中比 SCCA 更敏感。 （五） 悬浮微阵列检测 HPV 基因型 1.HPV 的生物学性状及分型： HPV 是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中广泛分布。 HPV 感染是当前发病率最高的性传播疾病之一，可以引起包括外生殖器尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌等多种生殖系统疾病。 HPV 病毒属于乳多空病毒科，无包膜，直径 45 55nm ，有 9 个开放性回读框架， E1 到 E7 为早期基因转录区， L1 和 L2 为晚期基因转录区。 HPV 可以分为高危型、可能是高危型或者中危型和低危型，（ ppt40 ）图片显示的是各种病变及其对应的 HPV 亚型。 2.HPV 与宫颈癌的关系：约 80 的宫颈癌与高危型 HPV 相关，其中以 16 ， 18 型呈高度相关性。 HPV 的感染类型与宫颈癌的组织学分型有关， HPVl6 型多见于宫颈鳞癌，而 HPVl8 型则主要见于宫颈腺癌，两者均与相应组织分型的宫颈癌预后均密切相关， HPVDNA 阳性者，其预后相对较差。宫颈癌中 90 以上的病例可以检测到 HPV 感染， HPV 的检出率及类型因不同国家和地区、不同标本来源以及不同检测方法而有所差异。持续性高危型 HPV 感染是 CIN 进展的重要条件，因此，对 HPV 感染进行准确的检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性。 3.HPV 分型悬浮微阵列的优点：采用通用引物方法和液态芯片检测平台，一次扩增即可以扩增多种亚型，一次检测即可区分 26 种亚型。灵敏度高，检测低限仅为 6-10copy/ml ，阳性信号和阴性信号比值高，容易判读。检测快，杂交反应只需要 15min ，而传统的杂交方法至少需要 2h 。可 96 孔板操作，适合于大规模筛查。方法简单、效率高，敏感度高，特异性强、重复性好，适合于大样本筛查，是最有效最准确的宫颈癌早期检测手段。 五、总结 液相芯片检测系统具有高通量、灵敏、准确、简单、快速、标本量少等优点，是极具优势的新一代检测技术。联合检测多种肿瘤标志物的液相芯片克服了传统免疫检测方法一次只能检测一项指标的缺点，真正实现高通量、多样本的快速检测，使临床医生和患者全面了解机体健康状况，有助于发现早期肿瘤，提供肿瘤诊断的阳性率、特异性、准确性，为临床提供早期诊断治疗的依据。其联合检测中的应用模式可归纳为微球编码、共价交联、结合反应、激光检测。 在生物科技商业化的背景下，国外知名大公司纷纷进行悬浮芯片的研发，给临床医学和检验医学的发展带来新的亮点；同时在研究方面，给了研究者更大的选择余地。虽然悬浮芯片在多个生物医学的领域中具有明显的优势，但是在基因表达谱分析、基因诊断、获得的基因信息量等方面，仍然无法和传统的基因芯片相比。悬浮芯片最大的缺点是不能连续在线监测待测样品中靶标物