RACE原理及实验步骤.ppt

BDSMART RACEcDNAAmplificationKitUserManual TableofContents SMART技术 原理 在合成cDNA的反应中事先加进的3 末端带Oligo dG 的SMART引物 由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA 在到达mRNA的5 末端时碰到真核mRNA特有的 帽子结构 即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个 dC SMART引物的Oligo dG 与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板 逆转录酶会自动转换模板 以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端 这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo dT 的起始引物序列 另一端有已知的SMART引物序列 合成第二链后可以利用通用引物进行扩增 由于有5 帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA 因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA 一 成分及另备物品 保存条件 1 ControlHumanPlacentalTotalRNA和BDSMARTIIAOligonucleotide在 70 C下保存 2 NucleoTrapGelExtractionKit室温下保存 3 其余试剂 20 C下保存 http www ppthi First strandcDNA合成 5 3 RACEPCR 另备物品 下列试剂需另外准备 由于SMART RACEcDNAAmplificationKit没有PCRpolymerase 可以使用以下物品 Advantage2PCRKit Cat Nos 639206 639207 Advantage2PolymeraseMix Cat Nos 639201 639202 二 引物设计 A 引物序列特异引物 GSPs 应当 23 28个核苷酸 GC含量为50 70 Tm大于或等于65 C 如果Tm 70 C可获得最好的结果 可使用降落PCR 至少需要两个特异引物才能进行完整的BDSMARTRACE 即用于5 RACEPCR的反义引物和用于3 RACEPCR的正义引物 如果只进行5 或3 RACE则只需一个特异引物 引物长度在23 28个核苷酸 长于30个核苷酸没有优势 模版 引物及RACE产物下图所示 Therelationshipofgene specificprimerstothecDNAtemplate B 引物在基因上的位置 BDSMARTRACEKit得到的扩增产物大于6 5kb 对引物加以筛选 使5 和3 RACE产物达到2kbC 降落PCR 明显增加BDSMARTRACE扩增的特异性 降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm高于通用引物的Tm 退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度 引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增 当引物的Tm 70 C时建议使用降落循环程序 D 巢式引物在首次试验时 不要使用巢式PCR 混合的通用引物 UPM 和基因特异引物 GSP 通常能得到较好的低的非特异性背景的RACE产物 但是 巢式特异引物可以作为探针在鉴定RACE产物的Southernblotting中使用 此外巢式PCR在使用特异引物进行5 or3 RACE存在高背景或高非特异性扩增时有必要使用 在巢式PCR中 使用外侧引物进行一个初步的扩增 如果扩增产物模糊不清 可以使用内部引物重新扩增初步产物的一部分 BDSMARTRACE指南包括了可选的步骤 指明了巢式引物能够被使用的地方 本试剂盒提供的通用巢式引物A可用于5 and3 RACE 按照上述指南可以设计巢式特异引物 巢式引物与外侧特异引物尽可能不重叠 如果因序列有限而必须重叠 其内部引物的3 末端的序列也要尽可能唯一 中文名称 巢式引物英文名称 nestedprimer定义 为巢式聚合酶链反应所设计的引物 第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的 推荐使用变性甲醛琼脂糖电泳检测RNA样品 哺乳动物的总RNA展示为两条4 5和1 9kb的带 分别对应28S和18S核糖体RNA 它们之间的亮度比率约为1 2 1 哺乳动物的PolyA RNA会产生0 5 12kb的弥散带 亮度较核糖体RNA带弱 RNA分析 四 3 RACE 5 RACE基本原理 经典的RACE技术是Frohman等 1988 发明的一项技术 主要通过RT PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5 和3 端 包括单边PCR和锚定PCR 该技术提出以来经过不断发展和完善 克服了早期技术步骤多 时间长 特异性差的缺点 race定义 cDNA末端快速扩增技术 rapidamplificationofcDNAends RACE 是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5 和3 末端的有效方法 以其简单 快速 廉价等优势而受到越来越多的重视 对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT PCR技术的改进 1 在5 端加尾时 采用poly C 而不是poly A 2 采用热启动PCR hotstartPCR 技术和降落PCR touchdownPCR 提高PCR反应的特异性 4 利用mRNA的3 末端的poly A 尾巴作为一个引物结合位点 以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo dT 30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA 然后用一个基因特异引物GSP1 genespecificprimer GSP 作为上游引物 用一个含有部分接头序列的通用引物UPM universalprimer UPM 作为下游引物 以cDNA第一链为模板 进行PCR循环 把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来 3 RACE流程图 SMARTTM5 RACE的原理 先利用mRNA的3 末端的poly A 尾巴作为一个引物结合位点 以Oligo dT 30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下 反转录合成标准第一链cDNA 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性 在反转录达到第一链的5 末端时自动加上3 5个 dC 残基 退火后 dC 残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo dG 通用接头引物配对后 转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头 然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM universalprimer UPM 作为上游引物 用一个基因特异引物2 GSP2genespecificprimer GSP 作为下游引物 以SMART第一链cDNA为模板 进行PCR循环 把目的基因5 末端的cDNA片段扩增出来 最终 从2个有相互重叠序列的3 5 RACE产物中获得全长cDNA 或者通过分析RACE产物的3 和5 端序列 合成相应引物扩增出全长cDNA 5 RACE流程图 五 cDNA末端的快速扩增 RACE 主要步骤 1 PCR反应混合液的准备 确保混合液体积足够所有的PCR反应和一次额外的反应 该混合液用于5 和3 RACE反应 对于50 lPCR反应 所混合的成份如下 2 漩涡混合 不要产生气泡 短暂离心 如果RNA是非人类的 可以跳过此步 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步 3 对于5 RACE 按表III准备PCR反应 在0 5 mlPCR管中按顺序加入所有成份 轻柔混合 如果RNA是非人类的 可以跳过此步 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步 对于3 RACE 按表IV准备PCR反应在0 5 mlPCR管中按顺序加入所有成份 轻柔混合 4 每管内覆盖2滴矿物油 加盖 Note 如使用热盖循环仪则不必加矿物油 5 使用下列程序之一启动循环仪 programs1和2用于5 和3 RACETFR和UPMPrimers的阳性对照 依据所使用的是polyA 还是总RNA来选择正确的循环次数 六 RACE产物的鉴定 RACE产物的鉴定使用3种方法 A 对比用GSPs和NGSPs得到的RACE产物 B Southernblotting C 克隆和测序 A和B需要巢式引物 A 对比用GSPs和NGSPs得到的RACE产物 对于5 RACE反应 将UPMMix和GSP1得到的初级扩增产物与UPM和NGSP1得到的扩增产物进行对比 对于3 RACE 将UPM和GSP2与UPM和NGSP2的扩增产物进行对比 当有多条扩增带时 巢式引物的扩增带应当稍小些 其中一些带应当消失 Note 不要使用NestedUniversalPrimerA NUP Southernblotting Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法 一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段 将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上 经干烤或者紫外线照射固定 再与相对应结构的标记探针进行杂交 用放射自显影或酶反应显色 从而检测特定DNA分子的含量 B SouthernBlotAnalysis当RACE产物有多条带时 用GSPs或NGSPs制作探针进行Southernblot可以有把握地确认真正的RACE产物带 通常5 RACE比3 RACE易出现多条带 1 琼脂糖凝胶电泳检测RACE产物 2 照相 转尼龙膜 3 准备探针 探针内不能有GSP1 orGSP2 的序列 可以将NGSP1 orNGSP2 进行末端标记 如果GSPs的5 和3 产物有重叠 则可以用GSP2做探针鉴定5 RACE产物 用GSP1做探针鉴定3 RACE产物 使用cDNA进行缺口翻译或随机引物扩增都可以制作探针 4 杂交 曝光 显影 5 与琼脂糖凝胶电泳照片进行对比 6 一旦得到了目的条带 使用NucleoTrapGelExtractionKit进行胶回收 分离DNA C RACE产物的克隆和测序 1 使用NucleoTrapGelExtractionKit进行RACE产物的回收和纯化 直接克隆到T A类型的PCR克隆载体上 2 使用32P 标记的NGSP进行菌落杂交或从GSP处开始测序 验证克隆的插入 对于5 RACE产物 推荐至少挑取8 10单克隆 以便在5 末端获得最大量的序列 一旦确认克隆内含有最大的特异基因的插入子 就尽可能获取较多的序列数据 可以得到完整ORF以及5 和3UTR 七 cDNA的第一链合成 注意事项主要步骤 1 在0 5 ml微型离心管中加入下列试剂 2 加入消毒水至终体积为5 l 3 混合并在小型离心机上短暂离心 4 70 C下温育2min 5 迅速在冰上冷却2min 7 在每个反应管中再加入下列试剂 已有5 l体积 2 l5XFirst StrandBuffer1 lDTT 20mM 1 ldNTPMix 10mM 1 lBDPowerScriptReverseTranscriptase总体积为10 l 6 短暂离心使成份聚集管底 10 42 C下温育1 5hr 注意 使用水浴或热循环仪会由于蒸发作用而降低反应液的体积 由此降低第一链的合成效率 8 小心混合管内组分 9 短暂离心使成份聚集管底 12 72 C下加热管7min 13 所得产品可以在 20 下保存3个月 到此已经得到了用于3 和5 RACE的cDNA样品 这些产物的量足以用于后期的RACE反应 如果使用LDPCR构建全长cDNA 请在此留出足够的产物用作膜板 八 PCR的阳性对照试验 注意事项主要步骤 1 为所有的PCR反应和1个额外的反应准备足够的主混合液 对于每个50 lPCR反应 混合下列试剂 34 5 lPCR纯度的水5 l10XBDAdvantage2PCRBuffer1 ldNTPMix 10mM inBDSMARTRACE或BDAdvantage2PCRKit 1 l50XBDAdvantage2PolymeraseMix总体积为41 5 l2 旋涡混合 无泡沫产生 短暂离心 3 按下表进行PCR反应的准备 按顺序在0 5 mlPCR管中加入各种成份 轻柔混合 4 每管加入2滴矿物油覆盖 加盖 注意 如果使用热盖循环仪则可以不用矿物油 5 按下列程序启动触减式PCR 6 每样取5 l在1 2 琼脂糖凝胶上进行电泳分析 其余45 l保存在 20 C 理想的试验结果 泳道2和5所示 5 RACE对照应当产生一条2 6 kb带 3 RACE对照反应应当产生一条2 9 kb带 注意 如果没有观察到这些带出现 将各PCR反应管重新放回到循环仪中 再进行5次循环 一定要在阳性对照反应能够在42个或更少的循环次数