【Y2H操作方法-HXY整理】.doc

实验步骤说明*： 1. 诱饵质粒pGBKT7-bait的构建 2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测【重要的前期准备】 3. 人胰腺cDNA文库的滴定和扩增【不用做了，直接用质粒】 4. 转化AH109酵母后转化子（阳性克隆）的筛选【顺序转化或共转化】 5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】* 2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测2.1 LacZ自激活的检测.2.2 HIS3自激活的检测2.3 融合蛋白对酵母菌的毒性检测4. 文库转化AH109酵母后转化子的筛选4.1 文库质粒转化pGBKT7-bait/AH109酵母l使用标准的PEG/LiAc转化法将文库质粒转化入已含有pGBKT7-bait质粒的AH109酵母，涂布在SD-Ade-His-Leu-Trp平板上进行重组子筛选4.2 报告基因ADE2、HIS3和lacZ激活的验证lADE2、HIS3的激活：酵母能够在SD-Ade-His-Leu-Trp平板生长lLacZ的激活：-半乳糖苷酶显色反应呈蓝色4.3 pACT2-cDNA质粒的获取：l从酵母中抽提质粒，得到pGBKT7-bait和pACT2-cDNA的混合物l转化E. coli，涂布在含Amp的LB平板上，由于质粒不相容性，转化子中便只含有pACT2-cDNA质粒l从转化成功的E. coli中抽提出pACT2-cDNA质粒5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】5.1 由于酵母双杂交的假阳性很普遍，所以筛选得到相互作用蛋白的cDNA序列之后，还应将分离出的各种pACT2-cDNA再次单独转化pGBKT7-bait/AH109酵母，即一对一验证，再次检测它们对报告基因的激活情况，排除假阳性5.2 将pACT2-cDNA质粒送测序，得到cDNA片段的序列，在NCBI数据库Blast查出其对应的蛋白质5.3 另外，还必须分析这些pACT2-cDNA质粒的构建情况。由于商品文库构建的特殊性，要特别关注这些插入的cDNA片段是否发生了frameshift5.4 在上述验证都通过的情况下，仍然需要用诸如免疫共沉淀、GST-pull down、细胞共定位等实验来对这些相互作用来进行验证 具体的操作步骤请仔细参看clontech公司的这三个操作手册：相关质粒载体【更多详细信息见质粒图谱】酵母双杂交系统3的质粒信息Fusion表位酵母筛选标记细菌筛选标记Cloning vectorspGBKT7DNA/baitc-MycTRP1kanamycinControl vectorspCL1GAL4LEU2ampicillin图2.3 pGBKT7的限制性酶切图谱pGBKT7的多克隆位点图谱pCL1质粒图谱另外附上：文库质粒的载体pACT2 和 AD-prey构建的载体pGADT7的信息：实验所用菌株基因型及其用途菌株基因型用途E coli DH5F-80dlacZM15 recAl endAl gurA96 thi-1 hsdR17(rk-mk+) supE44 relA1 deoR（lacZYA-argF）U169用于质粒的扩增与转化AH109MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4, gal80D, LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,URA3 : : MEL1UAS-MEL1 TATA-lacZ用于酵母双杂交中的诱饵融合蛋白的宿主菌及酵母双杂交筛选AH109酵母菌的报告基因： AH109酵母菌的表型：培养液和固体培养基l 大肠杆菌培养基及相关试剂LB培养基：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g加蒸馏水至1000mL，调整pH到7.0，高温高压灭菌。固体LB培养基：在液体LB培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5-2.0。配制抗生素培养基时，氨苄青霉素的最终浓度为60g/mL，卡那霉素的最终浓度为50g/mL。l 酵母培养基及相关试剂【注意：含有葡萄糖，灭菌时间不要超过20min，一般15min，过长时间导致碳化变黑】无氨基酸酵母氮源（YNB）为Difco产品；L-Arginine HCl、L-Histidine HCl monohydrate、L-Lysine HCl、L-Uracill购自Sigma；腺嘌呤半硫酸盐（Adenine hemisulfate salt）购自Amresco；其它各种氨基酸均为国产分析纯。YPD培养液：蛋白胨 20g酵母提取物 10g葡萄糖 20g加水至1000mL，调pH5.8，高温高压灭菌。YPDA培养液：在1L YPD培养基中加入15ml 0.2腺嘌呤半硫酸盐至终浓度为0.003，调pH5.8，灭菌 0.2%腺嘌呤半硫酸盐配方：0.4387g Ademin Sulfate 溶于200ml ddH2O 过滤灭菌，4保存固体YPDA培养基：YPDA培养液中加入琼脂粉至浓度为2.0。10省却成分培养基（简称10DO培养基）：按照下表的配方分别配制：一缺10DO：10DO/-Trp，10DO/-Leu二缺10DO：10DO/-Trp/-His，10DO/-Leu/-Trp三缺10DO：10DO/-Trp/-Leu/-His四缺10DO：10DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade各种氨基酸在10DO溶液中的浓度（按需要省去部分氨基酸）氨基酸10浓度L-Adenine hemisulfate salt 200 mg/L L-Arginine HCl 200 mg/L L-Histidine HCl monohydrate 200 mg/L L-Isoleucine 300 mg/L L-Leucine 1000 mg/L L-Lysine HCl 300 mg/L L-Methionine 200 mg/L L-Phenylalanine 500 mg/L L-Threonine 2000 mg/L L-Tryptophan 200 mg/L L-Tyrosine 300 mg/L L-Uracil 200 mg/L L-Valine 1500 mg/L 完全极限培养基(亦称缺陷型培养基、选择性压力培养基)：YNB 6.7g10DO 100MLGlucose 20g加水至1000mL，调pH5.8，灭菌。固体培养基：上述液体培养基加入琼脂粉至浓度2%。酵母转化试剂【化学法转化】10TE缓冲液： 0.1M Tris-HCl，10mM EDTA (pH 7.5)，高压灭菌。50%(w/v)PEG3350：PEG3350 50g,用灭菌的去离子水溶解，至体积达100mL。10LiAc ：1.0M LiAc，用稀释的醋酸调至pH7.5，高压灭菌。PEG/LiAc溶液（现用现配）：4/5体积的50%PEG3350, 1/10体积的10TE缓冲液和1/10体积的10LiAc混匀，备用。1TE/1LiAc溶液（现用现配）：1/10体积的10TE缓冲液，1/10体积的10LiAc，4/5体积的灭菌的去离子水，混匀，备用。担体DNA 10mg/ml：0.5g 鲱鱼精DNA溶于50ml TE中，磁力搅拌3h，分装于1.5mlEP管，-20保存。用时超声或沸水浴10min-半乳糖苷酶滤纸显色分析试剂X-gal储备液：X-gal溶于二甲基甲酰胺中，浓度20mg/mL，-20避光保存。Z Buffer：Na2HPO47H2O16.1g/LNaH2PO4H2O5.50g/LKCl0.75g/LMgSO47H2O0.246g/L调pH值至7.0，高压灭菌。Z Buffer/X-gal混合液(现用现配)：Z缓冲液100mL-巯基乙醇0.27mLX-gal储备液1.67mL感受态酵母菌的制备将酵母菌AH109菌株划线接种于YPDA平板上，30培养3-5d后，平板上长出白色或粉红色克隆；以灭菌的牙签挑取1个直径在2-3mm的克隆接种于装有1mL YPDA液体培养基的Eppendorf管中(若克隆直径小于2mm，应挑取数个克隆)，剧烈震荡5min以打散菌团；将之转入含50mL YPDA培养基的三角瓶中，于30 250rpm摇动培养16-18h，至酵母菌繁殖的稳定期(OD6001.5)；取30mL上述过夜培养物转入含300mL YPDA的三角瓶中，检查稀释培养物的OD600值，若必要，加入更多的过夜培养物直至OD600=0.2-0.3；于30 230rpm继续摇培养3h，此时OD600应为0.4-0.6；收集培养菌液于50mL离心管中，1000g，室温离心5min，弃上清；以25-50mL灭菌TE或蒸馏水重悬细菌沉淀，1000g，室温离心5min，弃上清；用1.5mL新鲜制备的、灭菌的1TE/1LiAc重悬沉淀，即为感受态酵母菌。质粒转化酵母转化实验分组组别质粒培养基预期LacZ表型阳性对照pCLlSD/-Leu蓝色阴性对照pGBKT7SD/-Trp白色实验组pGBKT7-baitSD/-Trp白色 0.1g诱饵质粒pGBKT7-bait、阴性对照质粒pGBKT7和阳性对照质粒pCLl分别与0.1mg鲱鱼精DNA于一新的1.5mL离心管中，混匀；加入100L酵母感受态细胞，震摇充分混匀；加入600L无菌的PEG/LiAc溶液，高速震摇以混匀；30 200rpm摇动30min；加入70L DMSO，轻轻颠倒混匀，切勿震摇；42水浴中热激(热休克)15min，冰浴1-2min；室温14000rpm离心5sec，移去上清，以500L无菌的1TE缓冲液重悬细胞；取100L涂布于相应的营养缺陷平板上，平放几分钟，至液体渗入琼脂中为止；于30倒置培养，进行营养缺陷型筛选，直至克隆出现，一般需要2-4天。-半乳糖苷酶滤膜分析用新鲜(如30生长2-4d)的，直径在1-3mm的酵母克隆进行-半乳糖苷酶分析；加入2-2.5mL新鲜配制的Z Buffer/X-gal溶液到干净的100mm的培养皿中；将一张直径大小合适的滤纸放入上述盛有Z Buffer/X-gal混合液的培养皿中浸湿；用