第三章谷氨酸生产菌特征、育种与扩大培养1

第三章 谷氨酸生产菌的特征 育种及扩大培养 目录contents 1 2 3 4 谷氨酸生产菌的主要特征 国内谷氨酸生产菌及其比较 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化 谷氨酸发酵的代谢控制育种策略 5 利用生物工程技术选育谷氨酸生产菌 6 菌种的扩大培养及种子的质量要求 第一节 谷氨酸生产菌的主要特征 一 现有谷氨酸生产菌的分类 现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属 短杆菌属 小杆菌属及节杆菌属中的细菌 1 棒状杆菌属 Corynebacterium 直到微弯的杆菌 一端膨大呈棒状 折断分裂形成 八 字形或栅状排列 葡萄糖发酵产酸 G 2短杆菌属 Brevibacterium 短的不分枝直杆菌 多数从葡萄糖发酵产酸 不发酵乳糖 G 3小杆菌属 Microbacterium 形态与棒状杆菌相似 发酵葡萄糖产酸弱 主要产乳酸 G 4节杆菌属 Arthrobacterium 培养过程中 细胞形态变化较大球菌杆菌 杆菌球菌 G G G G 能液化明胶 从碳水化合物产酸极少或不产酸 二 谷氨酸棒状杆菌基因组研究进展 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 GenBankNC 004369 目前应用发酵法生产L 乳酸常用的微生物仅有两大类 一类为细菌 多采用乳酸菌 另一类为根霉 根霉可以直接利用淀粉质原料生产L 乳酸 但是产酸量低 副产物多 转化率低 Sauer等构建了包含乳杆菌L 乳酸脱氢酶基因的毕氏酵母 它利用木糖发酵 初始浓度为100g L 生产L 乳酸达到58g L 比利用葡萄糖产生乳酸的水平高 基因工程育种 重组DNA技术 三 现有谷氨酸生成菌的主要特征 1 细胞形态球形 棒状以及短杆状 2 G 无芽孢 无鞭毛 不能运动 3 需氧型 生物素缺陷型微生物 4 脲酶强阳性 5 不分解淀粉 纤维素 油脂 酪蛋白以及明胶 6 发酵中菌体发生明显的形态变化 同时发生细胞膜渗透性的变化 7 CO2固定反应酶系活力强 8 异柠檬酸裂解酶活力弱 乙醛酸循环弱 9 酮戊二酸氧化能力微弱 10 NADPH2进入呼吸链能力弱 11 柠檬酸合成酶 乌头酸梅 异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强 12 能利用醋酸 不能利用石蜡 13 具有向环境中泄露谷氨酸的能力 14 不分解利用谷氨酸 并能耐高浓度的谷氨酸 产谷氨酸5 以上 第二节国内谷氨酸生产菌及其比较 1 形态特征短杆至小棒状 有时微弯曲 两端钝圆 不分枝 呈多种形态 单个 成对及 V 字形排列 G 胞内有横隔 不运动 无芽孢 一 北京棒杆菌 AS1299 的形态和生理特征 2 培养特征 普通肉汁琼脂平板 菌落圆形 24h白色 48h淡黄色 中央隆起 表面湿润 光滑 有光泽 边缘整齐且呈半透明状 无黏性 不产生水溶性色素 3 生理特征 对氧的要求 好氧及兼性厌氧 与温度的关系 菌株26 37 培养生长良好 不耐高温 41 生长较弱 pH的影响 Ph5 10均能生长 最适pH6 7 5 还原硝酸盐 反映强烈 石蕊牛奶培养 7d后微产碱 不水解淀粉 不分解纤维素 对尿素的耐力 2 6 以上生长受抑制 脲酶试验 强阳性反应 产酸物质的测定 G 果糖 甘露糖 蔗糖 麦芽糖迅速产酸 生长因素试验 生物素是必需生长因素 硫胺素明显促生长 二 钝齿棒杆菌 AS1542 的形态和生理特征 1 形态特征短杆至棒状 有时微弯曲 两端钝圆 不分枝 单个 成对及 V 字形排列 折断分裂 G 胞内有横隔 不运动 无芽孢 2 培养特征 普通肉汁琼脂平板 菌落圆形 近草黄色 表面湿润 光滑 无光泽 边缘顿齿状 较薄 半透明 无黏性 不产生水溶性色素 对氧的要求 兼性厌氧 与温度的关系 菌株20 37 培养生长良好 不耐高温 42 不生长 pH的影响 pH6 9生长良好 pH10生长微弱 pH4 5已不能生长 还原硝酸盐 反映强烈 石蕊牛奶培养 7d后微产碱 水解淀粉 不分解纤维素 对尿素的耐力 2 6 以上生长受抑制 脲酶试验 强阳性反应 产酸物质的测定 G 果糖 甘露糖 蔗糖 麦芽糖 水杨苷 七叶灵等迅速产酸 生长因素试验 生物素是必需生长因子 3 生理特征 三 天津短杆菌 T613 的形态和生理特征 典型的短杆状 有时微弯曲 两端稍钝圆 不分枝 单个 成对及 V 字形排列 折断分裂 G 不运动 无芽孢 1 形态特征 2 培养特征 普通肉汁琼脂平板 菌落圆形 浅黄色 表面湿润 光滑 隆起 边缘整齐 较薄 半透明 无黏性 不产生水溶性色素 3 生理特征 对氧的要求 好氧及兼性厌氧 与温度的关系 菌株26 37 培养生长良好 75 处理10min不再生长 pH的影响 pH6 10生长良好 pH5生长微弱 pH4和pH11已不能生长 还原硝酸盐 反映强烈 不水解淀粉 不分解纤维素 对尿素的耐力 5 以上生长受抑制 脲酶试验 强阳性反应 产酸物质的测定 G 果糖 甘露糖 蔗糖 麦芽糖 水杨苷 七叶灵 生长因素试验 生物素是必需生长因子 硫胺素是促生长作用 四 北京棒杆菌 7338 与钝齿棒杆菌 B9 的比较 后提取容易 收率较高 质量较好 分泌色素较多 2 5天津短杆菌 T613 与钝齿杆菌 B9 的比较 T613感染噬菌体时 不能换用B9 调换7338 第三节谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化 斜面和一 二级种子在不同培养条件下 细胞形态基本相似 斜面培养的菌体较细小 一 二级种子比斜面菌体大而粗壮 革兰氏染色深 多为短杆至棒杆状 有的微呈弯曲状 两端钝圆 无分枝 细胞排列呈单个 成对及 V 字形 有栅状或不规则聚块 分裂的细胞大小为0 7 0 9 1 0 3 4um 由于生物素充足 繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞 一 种子的菌体形态 二 谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态 长菌型细胞 发酵0 8h或0 10h 短杆至棒状 有的微弯曲状 细胞单个 成对及V字形排列 转移期细胞 发酵8 18h或10 20h 细胞开始伸长 膨大 在生物素贫乏的条件下 从谷氨酸非积累型转变成谷氨酸积累型 转移期有长菌型细胞 也有产酸型细胞 产酸型细胞 发酵16 20h后 细胞为含磷脂不足的异常状态 呈伸长 膨大 不规则状 缺乏V字形排列 发酵后期 细胞较长 呈有明显的横隔的多节细胞 产酸高 过量生物素 不同阶段的细胞形态则基本上没有明显的变化 菌体较粗壮 类似于长菌型细胞 典型的异常发酵 长菌体 耗糖快 耗尿素快 发酵周期短 低酸或不产酸 三 谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态 发酵前期感染噬菌体后 菌体细胞明显减少 细胞不规则 发圆 发胖 缺乏 字形排列 有明显的细胞碎片 严重时出现拉丝 拉网 互相堆在一起 几乎找不到完整的菌体细胞 类似蛛网或鱼翅状 在发酵中 后期感染噬菌体后 菌体细胞形态不规则 边缘不整齐 有的边缘似乎有许多毛刺状的东西 有细胞碎片 第四节 谷氨酸发酵的代谢控制育种 一 日常菌种工作 1 定期分纯1 2个月分离纯化一次 2 小剂量诱变刺激 用紫外线 10 20s 处理 可以淘汰生长微弱的菌株 并能激发溶原性噬菌体 使挑出来的菌产酸高 生长旺盛 无噬菌体感染 3 高产菌制作安瓿管 育种后分纯的高产菌种需保存到安瓿管中 防止菌种变异 二 选育耐高渗透压菌种 耐高糖突变株选育在含20 30 葡萄糖的平板上生长好的突变株 耐高谷氨酸突变株选育在含15 20 味精的平板上生长好的突变株 耐高糖 高谷氨酸突变株选育在含20 葡萄糖 15 味精的平板上生长好的突变株 三 选育不分解利用谷氨酸的突变株 选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株 四 选育细胞膜渗透性好的突变株 生物素亚适量 吐温 60 青霉素 温度敏感株 五 选育强化CO2固定反应的突变株六 选育减弱乙醛酸循环的突变株七 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到 酮戊二酸代谢的突变株八 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株九 选育强化能量代谢的突变株 耐谷氨酸 谷氨酸结构类似物 谷氨酰胺抗性突变株 第五节利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌 一 应用原生质体融合技术 钝齿棒杆菌B9 细胞个体大 易于提取 产酸率低 天津短杆菌TG 866 产酸率高 融合子F263 细胞个体大 产酸率高 二 应用转化法 三 应用转导法 四 应用重组DNA技术 第六节菌种的扩大培养和种子的质量要求 一 菌种扩大培养的目的 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间 保证生产水平 二 菌种扩大培养的过程 1 斜面菌种的培养 培养基 葡萄糖0 1 蛋白胨1 牛肉膏1 氯化钠0 25 酵母膏0 5 琼脂2 pH7 0 7 2 培养基特点 有利于菌体的生长 原料比较精细 生长斜面要求 32 生长18 24小时 生长良好 所使用斜面连续传代不超过3次 2 一级种子培养 摇瓶 培养条件 于1000ml三角瓶中 装液200 250ml 32 培养12小时 培养基 葡萄糖2 尿素0 5 玉米浆2 5 K2HPO40 1 FeSO42mg k MnSO42mg kgPH7 0 培养基特点 有利于菌体的生长 所使用的原料已经基本接近于发酵培养基 一级种子培养的质量要求 种龄 12hPH 6 4光密度 OD值净增0 5以上残糖 0 5 以下噬菌体检查 无镜检 菌体生长均匀 粗壮 排列整齐革兰氏染色 阳性反应 3 二级种子培养 种子罐 培养基 水解糖液3 尿素0 4 Na2HPO40 3 玉米浆2 5 KCl0 14 消泡剂0 5 1kg PH7 0 培养条件 在种子罐中培养 容积为发酵罐的1 32 培养7 10个小时 二级种子培养操作流程 种子罐配料 培养基加至罐体积60 75 空消 0 2MPa 130 50min 打料 实消 接种 0 1MPa 118 5min 二级种子