人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌生物热活性的影响.doc

人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌生物热活性的影响曹俊岭1，李宏1，范秀荣1，肖小河2*国家自然科学基金项目 (30500670)；国家重点基础研究发展计划(973计划)：2007CB512607，付鹏11 北京中医药大学东直门医院药学部 北京1007002 解放军302医院 全军中药研究所 北京100063摘要 目的：探讨人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌生物热活性的差异，为中药的活性筛选构建新的方法。方法：应用生物热动力学的方法，对人参皂苷Rg1、Rb1和Rd对生物模型的热活性的影响进行研究，计算总体发热量（Q），最高发热量（Pmax），最高发热时间(Tmax)代谢速率常数1（k1）和代谢速率常数2（k2）等热力学参数，应用主成分分析等统计方法对数据进行处理，并应用琼脂扩散法对各种皂苷的抑菌活性进行验证。结果 人参皂苷Rg1、Rb1在小剂量时对大肠杆菌代谢产热有轻微的促进作用，但随着剂量的增加则作用下降且产生抑制作用,但二者没有明显的差别；人参皂苷Rd从小剂量时就可使Pmax降低，k2下降，并随着剂量的增加而增加（P0.01），且在同等剂量下，其降低Pmax、k2的作用明显强于人参皂苷Rg1、Rb1（P0.01），各种皂苷的常规抑菌活性与生物热活性结果基本一致。结论 人参皂苷Rd对大肠杆菌的代谢产热有较强的抑制作用，人参皂苷Rg1、Rb1次之；同时为生物热动力学方法在药效物质筛选方面的应用提供依据。关键词 人参皂苷Rg1、Rb1、Rd 大肠杆菌 生物热活性Effects of Biothermo-activity of 3 Genosides on Escherichia coliCao Juning, Li Zulun, Xiao Xiaohe 1 Pharmacy Department, Dongzhimen Hospital Affiliate to Beijing University of TCM (Beijing 100700); 2 PLA Institute of Chinese Material Medica，302 Hospital of PLA (Beijing 100039 ); 3 College of Pharmacy, Chengdu University of TCM (Sichuan 610071)Abstract objective:To investigate the difference of biothermo-activity of 3 genosides on Escherichia coli and establish the method for activity screening of Chinese material medica. Method: Biothermokinetics was used to examine the effects of different genosides on Escherichia coli. Thermodynamics parameter, such as Q , Pmax, Tmax, k1 and k2 were calculated. And they were analysis by principal component analysis. Result: Genosides-Rg1 and Rb1 can promote the metabolic heat production of Escherichia coli in low dosages. But with increasing of dosage, the heat production of Escherichia coli is inhibited. The heat production of Escherichia coli is inhibited by Genosides -Rd. and it is superior to genosides -Rg1 and Rb1（P0.01）. Conclusions：Genosides -Rd has the best effects to inhibit the heat production of Escherichia coli and Ginsengside-Rg1 and Rb1 were inferior to it. Meanwhile, this lab also provide the evidences for the application of thermokinetics on activity screening of Chinese material medica.Key words 3 genosides， Escherichia coli，biothermo-activity生物热动力学方法实际上就是一种基于生物体生长代谢过程中能量转移和热变化测定的生物活性检测方法，也称生物热活性检测方法。多年来，在微生物代谢、组织细胞、中药物质基础筛选等多个方面已广泛应用1-4。随着仪器性能的不断提高，生物热分析技术在生命科学中也得到了长足的发展。人参为五加科植物人参的干燥根，主要由多种皂苷组成，现对其中的几种单体皂苷对大肠杆菌生物热活性的影响进行比较研究，为生物热力学方法在中药药效物质筛选中的应用提供依据。材料与方法1. 实验仪器 微量量热仪(瑞典TAM Air公司)2. 实验试剂 人参皂苷Rg1（批号110703-200322）、Rb1（批号110704-200318）对照品购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用；人参皂苷Rd购自成都思科华生物技术有限公司，供含量测定用，HPLC98，将各样品配置成所需浓度，微孔滤膜滤过除菌，备用。 3 实验方法3.1 培养基配置 L.B培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5g， NaCl 10 g，溶于1000 mL蒸馏水中，调pH=7.2后分装，121高压蒸气灭菌20 min，4冰箱中放置备用。3.2 微量热检测 无菌操作下将大肠杆菌接种于一定的液体培养基中，摇匀，向每个安瓿瓶中准确加入含1106细菌的培养基溶液，然后加入不同浓度样品的无菌溶液，加盖瓶塞，密封后放入37恒温的微量量热仪中，用数据采集软件跟踪记录细菌生长过程热功率时间曲线（P-t图），当曲线重新返回基线时，实验结束。据文献5计算总体发热量（Q），最高发热量（Pmax），最高发热时间(Tmax)代谢速率常数1（k1）和代谢速率常数2（k2）热力学参数。3.3采用琼脂扩散法，将高压灭菌后的固体琼脂培养基趁热倒入干燥灭菌的直径12 cm培养皿内，冷凝后再倒入一层，每层厚度2 mm，待培养基冷凝后，倒入0.3 mL菌悬液均匀涂布平板，然后用无菌金属打孔器打出直径6 mm，深2 mm的小孔，用无菌针头小心除去孔内残留琼脂，吸取不同浓度药液约200 L加入孔内，每一种药液作个平行，待药液全部渗入琼脂中，翻转平板，使培养基在上，置于恒温培养箱中37 培养24 h后，观察抑菌圈直径的大小。4统计学方法 数据计算应用Originpro7.5；应用SAS8.0软件，对热力学参数进行主成分分析；组间比采用单因素方差分析。实验结果1 微量热检测结果表1人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌代谢产热影响的热力学参数（n3）组别剂量（g/mL）Q(J)Tmax(min)Pmax(W)k1(10-2/min)k2(10-3/min)空 白63.270.97697.331.531805.3316.921.290.037.160.14Rg1564.961.55673.002.002057.334.041.250.017.360.211064.560.19669.003.002005.672.521.230.127.940.072066.430.39669.332.521789.003.001.230.116.840.204063.362.09710.674.511597.677.51*1.220.046.220.10*8063.170.07724.673.511460.335.51*1.240.045.970.06*Rb1564.270.10665.331.532062.679.501.240.087.720.111063.390.82704.6711.501644.6747.521.270.046.840.092063.841.25707.006.001525.0018.521.250.126.070.104063.280.96707.332.081458.6725.50*1.250.025.360.31*8063.190.06712.009.001316.6728.01*1.210.104.210.14*Rd566.850.46714.3317.501743.6752.601.280.076.300.221066.860.61762.6727.571683.3330.01*1.250.125.870.28*2065.610.66745.0017.521362.0029.51*1.250.074.830.37*4068.431.05696.675.51942.3326.50*1.230.103.950.21*8055.441.35700.675.51757.3311.50*1.220.102.130.09* 与空白组比P0.01, 与Rg1和Rb1同剂量相比P0.01。为了判断影响生物热活性的主要因素，以人参不同单体皂苷对大肠杆菌生物热活性影响的热力学参数Q、Tmax、Pmax、k1、k2的作为因子X1 、X2、X3、X4、X5，输入SAS统计软件，作主成分分析，分析结果表明在热力学参数中Pmax和k2为反映大肠杆菌代谢产热的主要指标，可基本表征对生物热活性的影响。因此主要针对Pmax、k2两个参数进行方差分析，由表1可知人参皂苷Rg1、Rb1在小剂量时均可使Pmax增加，k2加快，提示了以上几种单体皂苷对大肠杆菌代谢产热有轻微的促进作用，但随着剂量的增加则作用下降且产生抑制作用；人参皂苷Rd从小剂量时就可使Pmax降低，k2下降，并随着剂量的增加而增加（P0.01），且在同等剂量下，其降低Pmax、k2的作用明显强于人参皂苷Rg1、Rb1（P0.01），由此提示了人参皂苷Rd对大肠杆菌的代谢产热有较强的抑制作用。2 体外抑菌活性实验结果从表2可以知，人参皂苷Rg1和Rb1在80g/mL时才出现微弱的抑制作用；在同等剂量下，人参皂苷Rd抑菌环直径明显高于人参皂苷Rb1、Rg1（P0.01），人参皂苷Rd最强。这与3种人参皂苷单体影响大肠杆菌的生物热活性的结果基本吻合。表2人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌的常规抑菌活性结果（n=3,，）组别剂量（g/mL）抑菌环直径（mm）Rg150100200401.20.2802.40.3Rb150.30.1100.60.2200.80.2401.30.2802.50.2Rd50.70.1102.10.3203.70.6405.90.8807.70.4与同剂量Rg1、Rb1对比，P0.01；与同剂量Rg1、Rb1对比P0.05.“0”表示抑菌圈没有发生变化。讨 论基于能量代谢的药效物质筛选是近年来逐渐在生命科学中应用的方法，新陈代谢包括物质代谢和能量代谢两个方面，二者密不可分。生物体内机械能、化学能、热能及光、电等能量的相互转变就是能量代谢，在这些过程中，有一部分能量不可避免地会以热的形式散发出来，这就是代谢热，并且这种能量的转移和热变化在一定的阈值范围内呈现规律性变化，生物热动力学就是在这个基础上建立起来的。另一方面，中药的生物活性实质上就是中药药效物质对生物体新陈代谢过程中能量代谢或/和物质代谢的干预作用，这种干预作用也不可避免地将影响生物体生长代谢的能量转移和产热变化，这种相互作用可能是物理反应，也可能是化学反应，而任何反应发生时，均伴随有能量的转移和变化（表现为吸热或放热）。此外，无论生物体新陈代谢伴随的能量转移和热变化还是化学反应伴随的能量转移和热变化，都可以用生物热动力学特别是量热学方法定性定量地测定，都可以用不同生长代谢热动力学数学模型加以刻画，并可用热力学和中医药学理论特别是整体观、动态观和平衡观加以阐释6。多年来的研究结果表明，生物热动力学的方法可以作为较好的物质基础筛选的一种手段。本试验结果表明，由于应用生物热动力学的方法所检测到的指标较多，对此做主成分分析，找出能表征大肠杆菌生物热活性的具体指标Pmax、k2。人参皂苷Rd可使大肠杆菌的Pmax、k2明显降低，通过抑制大肠杆菌代谢产热而抑制大肠杆菌能量代谢的作用最强，同时，3种单体皂苷的常规抑菌活性实验结果也证实了这一点。生物热动力学的方法药物筛选方面已经得到了应用，但一个方法的建立需要大量的实验验证，因此，将对此作进一步的深入研究，为生物热动力学在中药研究中的应用推广打下基础。参考文献1