再生障碍性贫血的发病机制与临床治疗的研究进展.doc

再生障碍性贫血的发病机制与临床治疗的研究进展自1898年Paul首次报道再生障碍性贫血（再障）以来，人们经过100余年探索，已逐步加深了对该病发病机理的认识。目前认为，再障（aplastic anemia,AA）是一种骨髓造血的功能过度抑制性疾病，其病理机制呈高度异质性，不同的患者有不同的发病机制。多年来热点一直在造血干细胞、微环境及免疫系统上。从长远看，对再障患者的治疗应根据其不同的病理机制分型选择不同的治疗方案。现就近年来关于再障发病机制及临床治疗研究进展简述如下。1 AA与造血干细胞增殖缺陷近年来国内外学者研究认为造血干细胞增殖缺陷是再障的主要致病因素。贾志凌等通过对138例AA病人发病机制的实验研究发现，11例为造血干细胞缺损所致，加之干细胞缺损伴细胞免疫异常及造血干细胞缺损伴体液免疫异常者18例，干细胞缺损占93.5%，而造血微环境异常者仅6.67%.Novitz等通过对16例AA病人及7例正常志愿者的骨髓基质细胞长期培养及应用免疫磁珠法分离CD34阳性细胞的研究发现,AA病人的骨髓基质机制的研究已获突破性发展。近年来研究发现细胞免疫紊乱参与再障的发病，认为再障患者外周血T细胞亚群失衡，且异常激活的CD8细胞能抑制造血，具作用与其直接损害造血干细胞及CD8介导的造血因子失调有关。2.1 AA与活化的细胞毒性T细胞有关 AA骨髓造血功能衰竭主要与活化的细胞毒T细胞（CTL）有关，CTL的活化与增殖主要局限于骨髓之靶器官。AA活化的CTL体外表现出明显的造血抑制活性，可分泌多种造血负调控因子，如畸变的干扰素（aberrant INF-），肿瘤坏死因子、（TNF-、）及淋巴毒素（LT-）等，其中以INF-及INF-体外造血抑制效应最为显著。INF-及INF-体内外造血抑制作用可能是通过以下诸多途径进行的。2.1.1 INF-上调多种细胞受体（如IL-2R）的表达，导致多克隆T细胞扩增；T细胞功能失调，激活的T细胞分泌过量的IL-2造血调控因子，另外Th细胞产生的IL-2R存在于多种造血细胞的表面，是IL-2发挥生物作用的物质基础，因而导致骨髓造血抑制。有文献报道，CAA患者血清白介素2受体（sIL-2R）无明显异常，不能确定Sil-2R在CAA中是否发挥其造血抑制作用；而SAA患者血清中sIL-2R水平明显高于正常，可以确定sIL-2R在SAA发挥了造血抑制作用。国内文献报道，体外实验证明环孢素A能抑制激活的淋巴细胞分泌IL-2，阻断sIL-2R的诱导作用，血清sIL-2R增高明显者，选用免疫抑制剂环孢素A能取得满意效果，如SAA。2.1.2 AA患者体内高水平的INF-及TNF-可诱导其CD34+细胞上Fas抗原的表达增加，通过Fas抗原配体来启动凋亡过程，凋亡过程一旦启动，既使去除始动的因素，仍可继续发生。这意味着预防造血细胞凋亡更重要。推测再障患者淋巴细胞通过直接接触或分泌某些可溶性因子介导骨髓细胞凋亡。有实验研究表明，此过程中的造血抑制活性存在于血清中的IgG片段中，即血清存在的抑制性物质为IgG。患者血清IgG片段促进凋的机制尚不清楚。通过双色流式细胞仪分析，证实了患者血清IgG可特殊性吸附于正常人CD34+细胞表面，因此推测其促进CD34+细胞凋亡的作用可能与促进细胞表面分子交联，进而转导凋亡信号有关。一般认为细胞凋亡是一种基因指导下的程序性死亡，用抗凋亡基因（如bcl-2）干预造血干细胞凋亡的过程可能开辟造血衰竭基因治疗的新篇章。另外刘红等报道，2例重型再生障碍性贫血患者血清IgG片段均可加速CD34+细胞凋亡的作用，使用甲基泼尼松龙治疗，结果显示患者血清IgG片段的造血抑制作用与促进CD34+细胞凋亡的作用消失，提示甲基泼尼龙可能是治疗此类患者的最佳选择。2.1.3 INF-还能强烈诱导某些细胞内基因（如氧化氮合成酶基因）表达，通过促进一氧化氮合成及释放来发挥其造血抑制作用。此外，AA活化的CTL体内可通过细胞间直接作用来杀伤其造血细胞。2.2 AA与多种细胞因子分泌紊乱2.2.1 AA与G-CSF 关于再障患者体内G-CSF水平报道不一。有实验研究表现，再障患者体内缺乏G-CSF。相关分析实现G-CSF与CD4亚群及CD4/CD8呈正相关，而与INF呈负相关。而在SAA患者中，G-CSF的作用较为明确。临床研究表明，免疫抑制剂佐以造血细胞因子（包括G-CSFak GM-CSF、Epo等）治疗，可以有效地提高SAA的疗效。是否与SAA患者体内缺乏造血细胞因子有关？其机制至今不甚明确。有实验研究表明，患者血清中造血细胞因子的水平能与SAA-I的发病机制有关，血清中G-CSF正常的SAA-I患者有可能是由于某种原因损伤微环境为主，而造血干细胞末被损伤或损伤程度较轻，因此使用免疫抑制剂治疗后易于使造血恢复，故治疗所需疗程较短，疗效好；而血清中G-CSF水平增高的患者可能主要与造血干细胞受损有关，而造血微环境损伤轻微或未被损伤，尚能代偿性分泌大量的促进造血所需的造血细胞因子。因此，此类患者恢复造血缓慢，治疗疗程长，且随造血功能的逐渐恢复，所需造血细胞因子的量逐渐减少，故体内G-CSF水平逐渐降致正常，但确切机制尚进一步研究。因此，检测SAA患者G-CSF水平有助于判断患者的病情及其预后。2.2.2 AA与IL-6 有实验研究表明再障患者IL-6水平增高，推测其原因有：（1）再障患者造血功能低下，机体代偿性分泌IL-6以促进造血；（2）患者CD8细胞激活，使分泌TNF、INF增高，有间接刺激IL-6分泌的作用。相关分析发现IL-6与再障患者外周血白细胞数及CD4细胞呈负相关，揭示出IL-6的变化与再障的细胞免疫异常及造血抑制相联系，并反映细胞因子网络失调在再障发病中所起作用的复杂性。2.2.3 AA与IL-8 IL-8是细胞趋化因子家族的成员之一。近年来研究发现，IL-8又是造血功能相关，也证实再障发病中感染性因素的参与，以及异常的T细胞影响IL-8分泌。有研究表明，再障患者IL-8水平明显高于正常对照组，其中SAA患者IL-8水平升高更为显著，其原因可能是患者细胞及体液免疫低下，极易合并感染而导致IL-8水平升高；另一方面，有研究表明，再障患者体内异常增高及活化的免疫效应细胞，对骨髓造血祖细胞的直接或间接损伤是导致再障发生的重要机制，故IL-8水平上升可能与免疫活性细胞对骨髓造血系统的非炎症性损伤相关。但是由于IL-8对体内外造血祖细胞增殖的负调节作用，再障患者体内显著升高的IL-8很可能同时或进一步加重了对再障骨髓造血功能抑制的病理过程。研究再障患者IL-8表达，对于其发病机制探讨及指导治疗具有重要意义。总之，近年来大量临床及实验室的资料表明，免疫功能障碍及细胞因子分泌紊乱参与再障发病。对于免疫异常型再障应予以免疫调节。（1）既往临床研究证实，雄性激素治疗CAA疗效肯定，其中丙酸睾丸酮及力龙治疗CAA的有效率分别为44.0%及59.5%；（2）另外据报道，采用PHA辅以654-2、康力龙治疗再障性贫血总有效率（90.0%）比单用雄性激素（56.1%）大大提高，治疗急性型再障的有效率更高（80%），且未发生过敏致死现象。此法简便、经济、安全、疗效好，适合于基层医院广泛应用。（3）作为特异性免疫抑制剂，环孢毒素A（CsA）无论单用或与其它免疫抑制剂联合应用，其治疗AA疗效确切性已获公认。自1984年Finlay首次报道应用CsA治疗SAA获得成功至今，CsA已广泛应用于各种不同类型AA的治疗。CsA治疗AA的确切机制尚未完全明了，研究结果表现，CsA可通过阻断IL-2R来预防CTL的活化；CsA还能抑制活化的CTL分泌过量IL-2及INF-。我们汇总国内外有关应用CsA治疗368例再障的报道，其总有效率为57%，基中SAA为60%，CAA为59%，纯红再障（PRCA）为48%。单用CsA有效率为51%，与一种或两种药物（雄激素ATG、rhG、esF及Epo等）合用为53%，与三种或以上药物合用为69%。（4）有文献报道，长效睾丸酮（TLD）合并环孢霉素A治疗CAA。在国外已作为一线药物广泛应用于CAA的治疗。TLD+CsA治疗CAA疗效高于单用TLD组更为良好、迅速，少数可完全恢复正常。提示适宜的促造血药物联合免疫抑制治疗可望彻底治愈本病。初步临床研究结果表示TLD+CsA是治疗CAA颇有前途的治疗方案，为CAA一线治疗手段。3 AA与骨髓微环境损伤骨髓微环境损伤是AA发病机制之一。同时再障骨髓微环境的紊乱可诱使造血干细胞某些抗原（如Fas）表达发生改变，使造血干细胞易发生凋亡，而参与再障发生。有实验研究表明，川芎嗪能促进再障小鼠骨髓微血管的修复，增加对骨髓的供氧，促进骨髓造血基质细胞生长及其粘附功能。造血基质细胞应该是能粘附造血干细胞并直接支持其增殖分化形成造血岛的基质细胞。川芎嗪通过改善骨髓微环境而使骨髓造血细胞增生。在AA的常规治疗中，同时应用川芎嗪治疗，通过改善 骨髓微循环，有利骨髓造血功能的恢复。综上所述，AA理复杂，目前尚未完全明了，治疗十分棘手，公认的骨髓移植疗法生存率为75%，但受到供体和其它因素的限制，开展有一定难度，因而针对不同的病因及发病机制进行个体化治疗具有重要意义。如干细胞缺损型应予骨髓或外周血或脐血干细胞移植；免疫缺陷型应予纠正免疫缺陷等治疗，再障作为一种造血负调控亢进“模型”，是一种危害性极大的血液病。目前，关于再障的发病机制尚有许多不明确的方面，临床治疗并不理想，亟待进一步深入研究。心脑血管疾病的血浆纤维蛋白原检测 近年来，我科测定了多项与心脑血管疾病有关的检验指标，其中发现以纤维蛋白原的变化较为明显。而且随着纤维蛋白原（Fg）的治疗，临床治疗效果也明显好转。现将我科检测结果报告如下：1 对象： 1.1 正常对照组，共40人，年龄为21-56岁，其中男24名，女16名，均为健康体检人员（排除心脑血管疾病等）。 1.2 脑梗塞患者组，均为我院住院病人，经CT诊断证实，共150人，年龄为36-60岁，其中男110人，女40人，均符合脑梗塞诊断标准。 1.3 冠心病组，均为我院住院病人，共70人，年龄未35-62岁，其中男50人，女为20人，均符合冠心病诊断标准。2 方法： 采用凝固法，仪器为MPG-3D多能双通道血液凝聚仪，试剂购自上海太阳公司。3 结果：组 别nFg (g/l) X S正常对照组402.910.98脑梗塞组1503.890.73冠心病组703.520.814 讨论： 随着人民生活水平的不断提高，心脑血管疾病人群也不断增加，提前预防此病的发生无疑有着重要的意义，其中血浆纤维蛋白原的检测也是重要一项。我科测定的一些数据表明纤维蛋白原的变化比较明显，流行病学研究证实，血浆纤维蛋白原的升高是血栓形成的危险因素。近年来又有许多学者认为血浆纤维蛋白原可作为心脑血管疾病的危险因素。其水平升高致备栓形成的机制可认为有以下几点： 4.1 纤维蛋白原的升高，促进血液高凝状态，进而形成血栓。 4.2 加速动脉硬化的发生。 4.3 通过血压和血粘度减慢血流速度。现代医学认为动脉粥样硬化以及血栓形成，而纤维蛋白原在这个过程中起着重要艇。因此，测定血浆纤维蛋白原对预防心脑血管疾病的发生有着十分重要的意义。怎样看待血液及尿分析仪的过筛作用当前，自动化的血液及尿分析仪，在我国已相当普及。它不仅大大提高了临床检验的效率，减轻劳动强度，而且在一定程度上也提高了检验的精密度和准确性。这类仪器的显著特点之一是，将原先要在显微镜下辨认或计数的细胞，改变为根据细胞的大小、内部和表面结构、加入特殊试剂(如溶血剂、细胞化学试剂和染色剂等)后细胞的变化，有测量其电阻、对高频电磁波的传导性、在不同角度测细胞对光的散射程度以及用光度计测定颜色变化等光学和电学方法，直接或间接地加以计数和区分。这些方法历经数十年的研究、改进和实际应用的考 验，认为方法已成熟，并经国外的一些法定机构(如美国的FDA)批准后才进入市场的。但它们毕竟不是在显微镜下直接观察细胞，在有些情况，特别是病理条件下，(如血中出现异常白细胞、有核红细胞；尿中存在不典型的细胞和管型等)其测定结果并不可靠或难以确定，还需要在显微镜下进行复检(review)，这是经过多年实践后的一致看法，并且也是产品监控机构及所有仪器厂家所承认并要求做到的。因此说，这类仪器仅仅是一种过筛性质的仪器。当前，国内在对待这类仪器的过筛作用的问题上，存在两种倾向。一是完全“信赖”这种仪器，不管有无出现异常结果，一律不作复检，这是主要倾向。这里除了认识上的问题以外，主要是怕麻烦，图省事，是管理上的问题。另一种倾向是，认为这类仪器不可靠，全部都要镜下复检。关于前一种倾向，其谬误是显而易见的。国内外大量报道已经证明，迄今无论多么先进的仪器，都不能完全代替人工镜下观察。因此在仪器报出异常结果时，一定要进行镜下复检。后一种倾向认为，任何标本都必需人工镜检，完全否定血液和尿分析仪的过筛作用，这也有失偏颇。兹分析如下。一、对传统方法的客观评价这里说的传统方法，是指自动化仪器出现以前的那些手工方法。在有些临床医生和检验人员眼中，传统方法是最靠得住，甚至是最好的方法。果真如此吗?以下分别讨论。1血细胞分析：传统的显微镜下计数红白细胞的方法，不仅费时，而且要十分专注；技术要求高，劳动强度大；取样吸管、计算板的精确性影响很大。特别是实际计数的细胞很少，细胞在计数板上随机散布的“天然”差异大，因而其精密度和准确性都比较差。关于白细胞分类，常规的手工分类所计数的细胞少(仅100个)，细胞在涂片上分布不均，所以精密度差。加之镜下计数操作费时，制片和染色难以标准化，识别异常细胞需要相当的经验和血液学知识，所以对于没有受过专门训练的常规血液检验人员，经常会遗漏或误判偶见的异常细胞。据一篇美国文献报道，即使是有经验的检验技师，对于同一血片中常见的单核细胞计数(百分比)，相互之间也往往有相当差异。此外，由于手工法耗费时间多，技术要求高，故价格(收费)也高。2尿常规(手工)检验：传统的尿常规手工检验，操作烦琐，精密度和准确性差，其化学检查，方法繁多，没有标准化，灵敏度和特异性存在诸多问题。尿沉渣镜检问题尤多，撇开取尿量、实际观察和计数的尿量(视野数)等等有很大的随意性不说，单就对细胞和管型的正确辨认来说，就有相当难度。很多工作多年的尿检人员，不能准确识别和区分肾小管上皮细胞(即小圆上皮、肾上皮细胞)和泌尿道深层上皮细胞以及各种管型。一份尿标本，如果按正规操作，从取样，各种物理、化学试验，量比重，离心沉淀，吸取一定量沉渣置显微镜下仔细检查，是要耗费很多时间的。很难想象，在一个标本量很大，特别是在门诊条件下，人员配备又少，怎能完成任务?如果一定要严格按正规操作办，一定要多配人员，提高收费(人工将是最大的成本)，并要改进方法，尽量采用自动化仪器。二、自动化仪器的优越性，不足和补救措施1血液分析仪：自动化仪器的优点不仅是速度快，效率高，而且有一套完整的校准和质量控制体系，多采用规范化的操作方法和商品化试剂，故检验结果相对可靠，各实验室之间的可比性强。即使在问题较多的白细胞分类方面，由于它计数的细胞数多，(至少5000-8000个)对个别细胞偶尔的误判，不影响整体结果。相反，在手工分类时，占百分比很低，偶被忽略的异常细胞，在用仪器计数时，由于计数细胞多，却可在直方图上反映出来，提示要注意镜下仔细复查。从这一点来说，它似乎比手工法更要信。但另一方面，细胞的内部结构，如核的形状、染色质的粗细、有无核仁、核仁数目及形态；胞浆内有无颗粒及颗粒性质，浆内有无其它内含物等等这些区别和鉴定异常细胞的重要指标，仪器是无法提供的。因此当仪器所给出的直方图或结果只要有任何一项不正常(包括白细胞、红细胞、血小板)，都必须涂片染色，进行镜下复检，加以补救。实际上复检应包括两步：首先是一般性浏览涂片，观察和估计白细胞、血小板的数量是否大致相符；红细胞的形态、染色有无异常；有无寄生虫；血小板、白细胞形态有无异常，有无幼稚细胞等等。上述浏览如未发现异常，或未见与仪器测定结果不符，即可按仪器结果报告。如发现任何细胞有形态(含染色)异常，应加以描述并报告。如发现白细胞分类两者不符，则进行下一步人工分类；如发现血小板或白细胞(估计)结果与仪器明显不符，还应用手工法进行检查、核对或校正。这样就可以避免将宝贵的时间无谓地浪费在一些正常标本上面，而把精力集中在需要仔细镜下复检的“刀刃”上，以提高工作质量和效益。以仪器法为主，结合必要时的镜下手工复检，已成为当前国内外血细胞分析普遍采用的模式。据报告，经11个床位数不等的医院调查统计，在用了带分类的自动化仪器之后，各医院减少手工分类40%85%，平均减少60%。2尿分析：和血液分析一样，尿分析也包括仪器(试条+试条读数仪)检测和沉渣镜下检查两个方面。读数仪是一台反射式光度计，是一项很成熟的技术，兹不赘述。关于试条，目前比较成熟并经NCCLS列入GP16-A文件中的有10项。在这里，我们不想对所有项目进行评述，因为每个项目从提出原理，到设计到定型完成，都经过无数次的试验、改进，国内外刊物上已发表地很多评价文章。一般地讲，只要尿标本采集、运送合格，在室温下二小时内测定完成，并完全按厂家说明书的要求去做，(包括仪器的校准、规范的操作，严格的质控等，)作为一种过筛试验，其敏感性和特异性是完全可以接受的。举例来说，过筛白细胞是基于白细胞酯酶的反应。已知中性粒细胞和单核细胞都含有酯酶，前者含特异性酯酶(又称氯乙酸萘酯酶)，后者含非特异性酯酶(又称乙酸萘酯酶)。一般泌尿系统感染时，从尿中排出的主要是一些吞噬细胞，如中性粒细胞、单核细胞(包括源自单核细胞的巨噬细胞)，淋巴细胞极少见。故检