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GST标签蛋白纯化原理在实验中有过被高等教育的教授骂过：别人让你吃屎，你就去吃屎么？或者稍微高级点的问候声：你有脑子么？请稍微忽视当事人的失落、自尊心碎一地的感受，苦难不是一种财富，对苦难的反思才是一种财富。在实验时，或许着急按照步骤一步一步的做下来，而没有肯定的问自己：为什么要这样做？为什么要加这样的试剂？所以忽视了一些看似无关紧要的细节，坏结果便发生了。回归原理部分，回归解决若干个为什么的问题，让我们的实验更加规范化。所以在接下来若干个专题阐述GST标签蛋白纯化的实验时，生物日记实验室部落首先搞清楚GST蛋白纯化的原理。 当别人问为什么时，你知道为什么么Just why? why? why?GST标签蛋白纯化原理重组标签蛋白纯化利用谷胱甘肽的结构能够和GST（谷胱甘肽S-转移酶）的结合位点互补，谷胱甘肽通过SH基团与琼脂糖介质上的环氧乙烷基团通过环氧激活特异性偶联在琼脂糖介质上，带有GST的标签蛋白与琼脂糖介质上交联的谷胱甘肽配体互补性结合，这种可逆性的结合在温和、非变性的条件下通过加入还原型谷胱甘肽洗脱下来，杂质通过结合缓冲液被洗脱去除，从而分离目的蛋白。如果需要将GST标签从目的蛋白上除去，则可将蛋白酶结合到柱子上，在标签蛋白与谷胱甘肽结合时使用蛋白酶位点特异性切割，也可在洗脱之后再酶切。另外，蛋白质的性质、载体的选择、宿主菌、表达和纯化的条件不同都能使最终标签蛋白的产量有很大的差别。目的基因的表达在选择合适的表达载体时，应该注意载体的克隆位点、蛋白酶切位点、标签的位置、编码框等多种因素。载体的选择pGEX载体可用于构建可诱导、高水平表达目的基因片段，带有GST标签蛋白通过特定的目的基因或者基因片段插入到pGEX的多克隆位点，在pGEX载体上带有laclp基因，该基因表达产物作为抑制剂结合在tac启动子的操纵子区，而在乳糖类似物IPTG的诱导下，目的基因能够在tac启动子的调控下表达目的蛋白。宿主菌的选择在选择宿主菌时，大部分大肠杆菌都能够克隆和表达pGEX载体，如果要获得全长的标签蛋白，一些特殊的工程菌即蛋白酶Lon、OmpT等缺失的菌种能够保护目的蛋白不被宿主菌降解，获得全长的标签蛋白，并且产量也可能更高。大肠杆菌BL21是获得GST标签蛋白比较合适的宿主菌种，该菌种缺失Lon、OmpT两种蛋白酶，能够较高水平表达蛋白。将目的基因DNA片段的编码区插入到载体上，插入的DNA片段的编码区不能超过2 Kb，插入的末端序列和载体上的末端序列互补结合，目的基因片段在宿主细胞内表达，从多个克隆的宿主菌中筛选出最佳蛋白表达水平及相应生长条件，进行规模化培养。在筛选最佳宿主菌时，应考虑细菌克隆、细菌培养（培养基、含氧量、生长温度、密度、诱导条件等）等因素。后记：每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论
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