动物源抗菌肽的研究现状和展望

动物源抗菌肽的研究现状和展望 汪以真 浙江大学饲料科学研究所 生物饲料安全与污染防控国家工程实验室 动物分子营养学教育部重点实验 室 动物营养与饲料农业部重点开放实验室 杭州 310058 摘 要 动物源抗菌肽是机体先天免疫系统的重要效应分子 因其具有广谱高效抗菌活性 细胞选择性及 不易产生耐药性等特点 一直被人们认为是抗生素的理想替代品 此外 由于动物体自身分泌的抗菌肽远 未达到抑制细菌所需浓度 因此其生物学功能不仅局限于抗菌活性 大量研究表明 抗菌肽不仅具有抗细 菌 抗病毒 抗真菌 抗肿瘤等效果 在体内还表现出抗炎症反应 招募免疫细胞 促进上皮损伤修复 促进细胞吞噬细菌等重要作用 然而抗菌肽在一些方面的研究尚不透彻或存在争议 如抗菌肽是否存在耐 药性以及通过重组表达技术生产的抗菌肽是否能安全有效的应用 关于抗菌肽的一些生物学功能与分子机 制还有待系统深入的研究 如抗菌肽的构效关系 抗菌肽对益生菌的影响 抗菌肽与抗生素的互作效应 抗菌肽的稳定性及其吸收与代谢情况 营养物质调控内源抗菌肽的表达等 因此本文旨在从动物源抗菌肽 的生物学功能 作用机制 稳定性与吸收 表达规律与营养调控 分子改良以及重组表达 6 大方面进行综 述 为研发新型 高效 环保型抗生素替代品提供重要信息和策略 关键词 抗菌肽 生物学功能 稳定性 表达规律 分子改良 重组表达 中图分类号 S816 7 抗菌肽 又名宿主防御肽 是机体抵抗外来致病菌侵袭的重要屏障 成熟抗菌肽一般包含 12 100 个 氨基酸残基 由于其带正电荷 呈两亲性的分子结构 使得其便于与带负电荷的微生物膜或其他细胞靶点 相互作用 1 人们一直认为抗菌肽具有广谱抗菌 不易产生耐药性 无残留等优点 然而随着对抗菌肽研 究的不断深入 人们发现它并不是 万能的 某些细菌仍然能对抗菌肽产生耐药性 而且某些抗菌肽对动 物体内的益生菌也有一定的杀伤作用 另外 外源抗菌肽的吸收 在动物体内的稳定性以及与抗生素相互 影响等都不甚明了 鉴于此 本文从生物学功能与作用机制 稳定性与吸收 表达规律与营养调控 分子 改良以及重组表达 6 个方面对动物源抗菌肽的研究现状作一系统阐述 1 抗菌肽的生物学功能及作用机制 1 1 抗菌肽的抗菌功能与机制 抗菌肽可以通过破坏细菌细胞膜作用 直接快速地杀伤细菌 且抗菌谱广 其自身独特的氨基酸组成 大小 电荷 空间构像和结构 两亲性 疏水性和膜的流动性及组成等使得其拥有独特的抗菌机制 尽管 目前尚没有一个涵盖所有抗菌肽作用机制的理论 但大家公认的主要为膜作用机制和胞内作用机制 2 细菌 真菌和真核生物细胞膜是大多数抗菌肽作用的首要靶点 抗菌肽通常定位在细菌膜的表面 当 肽浓度达到一定阈值时破坏细菌细胞膜 3 而抗菌肽作用于微生物细胞膜包括非受体结合和受体结合 2 种 机制 多数微生物外层带负电荷与阳离子抗菌肽非受体结合 有学者观察了 10 种不同动物源的抗菌肽对 革兰氏阴性菌大肠杆菌 如 ATCC25922 和革兰氏阳性菌 如 ATCC25923 的作用机制 结果表明 大 多数受试抗菌肽都能破坏细菌细胞膜 使其内容物泄漏 出现空泡化 此外还发现抗菌肽 Protegrin 1 PG 1 具 有胞内作用靶点 能够与细菌 DNA 结合 抑制蛋白质合成 4 5 其他研究者也发现一些抗菌肽具有破膜机 制和多种胞内作用机制 如 Lv 等 6 发现多种杂合肽透过细菌细胞膜 破坏膜完整性导致细菌死亡 Lan 等 7 发现抗菌肽 Gloverin 能抑制 RNA 合成 Hwang 等 8 De Smet 等 9 先后发现抗菌肽 Indolicidin PR39 和 Attacins 能抑制蛋白质合成 最新研究表明 抗菌肽的杀菌机制远非如此 Chu 等 10 报道抗菌肽 Defensin 6 可以结合到细菌表面 自我组装形成一些小纤维和纳米样纤维包裹在鼠伤寒沙门氏菌周围 减少细菌黏附到肠道黏膜进而保护机 体 本课题组也发现猪源 hepcidin 能够使大肠杆菌 K88 发生聚团 形成网状结构包裹 1 2 抗菌肽的免疫调节作用与机制 抗菌肽在机体内的浓度低于 2 g mL 远小于其杀菌浓度 但却可以在生理环境下调节免疫细胞功能 越来越多的研究表明免疫调节活性是抗菌肽发挥的主要生物学功能 11 12 抗菌肽的免疫调节功能主要包括 1 调节机体炎症水平 抗菌肽发挥炎症调节功能依赖多种机制 如 Niyonsaba 等 13 研究表明 人抗菌肽 LL 37 能抑制核转录因子 B NF B 亚单位 p65 的移位 激活丝裂原活化蛋白激酶 MAPK 和磷脂酰 肌醇 3 激酶 PI3K 信号通路选择性上调抑炎因子的表达 Mookherjee 14 也发现 LL 37 通过与脂多糖 LPS 直接结合 从而抑制 Toll 样受体 TLR 4 及下游信号通路的激活等 同时 LL 37 可以降低 LPS 诱导的小鼠及人嗜中性粒细胞 14 树突状细胞 15 和 B 淋巴细胞 11 的促炎因子的异常高表达 2 通过诱导 或增加趋化因子的分泌间接发挥趋化作用 Niyonsaba 等 13 研究发现 在低生理浓度下 抗菌肽能够诱发 免疫细胞趋化因子的产生 如人防御素可通过诱导肥大细胞脱粒和激活来招募中性粒细胞 进一步刺激支 气管上皮细胞中白细胞介素 8 IL 8 的转录和分泌 在稍高生理浓度下 抗菌肽自身作为趋化因子 募 集粒性白细胞到感染部位发挥先天和适应性免疫反应作用 如 LL 37 可以介导 CXCR2 受体和甲酰肽受体 2 FPR2 增加钙离子流出 进而趋化外周血单核细胞和嗜中性粒细胞 Yang 等 16 和 Zhang 等 17 研究发 现 LL 37 同时通过激活 FPR2 诱导单核细胞的趋药性 相似的 人 防御素 2 hBD 2 人 防御素 3 hBD 3 可以通过 CC 类趋化因子受体 2 CCR2 趋化单核细胞 17 3 启动和调节特异性免疫 若先 天性免疫不足以消除感染 抗菌肽则通过信号传递途径启动并扩大宿主的特异性免疫反应 Gracia 等 18 研 究结果表明 注射蛋白转导域 PTd 和抗菌肽 HH2 CpG 可以提高 100 倍免疫球蛋白 G IgG 的分泌水 平 并提高免疫球蛋白亚型 IgG2a 和 IgG1 的抗体水平 4 直接增强机体抗细菌感染能力 Chromek 等 19 和 Nizet 等 20 研究表明 CRAMP 基因敲除小鼠在链球菌 A 的感染下更易导致皮肤坏死 并且更容易引起 泌尿系统的感染 5 通过特异受体激活免疫细胞功能 Lande 等 21 和 Vandamme 等 22 研究结果表明 LL 37 与自身 DNA 形成复合体 进而通过 TLR9 信号通路激活浆细胞样 DC 细胞 引起干扰素 IFN 的 产生与自免疫型 T 细胞的激活 1 3 抗菌肽的屏障作用与机制 动物肠道 泌尿道和呼吸道的上皮细胞均可表达抗菌肽 近年来诸多研究表明抗菌肽在动物黏膜和皮 肤防御方面起重要作用 抗菌肽发挥的作用不仅是杀灭病原菌 还能通过增强上皮组织的屏障功能来提高 机体对病原微生物的抵抗能力 如 Otte 等 23 发现 LL 37 能够诱导血管内皮生长因子和角质形成细胞生长因 子等多种细胞生长因子表达 刺激肠上皮细胞生长 保证肠上皮组织屏障的完整性 还能够通过与纤维状 肌动蛋白发生作用使得肺泡上皮细胞硬度增加 从而增强机体对铜绿假单孢菌入侵的防御能力 肠上皮细 胞间紧密连接可以调节肠黏膜屏障通透性和维持肠上皮细胞紧密性 是肠道黏膜屏障中至关重要的结构 而近年来有研究表明抗菌肽可以调控紧密连接蛋白的表达 从而影响肠道黏膜屏障的通透性 如人 防 御素 1 hBD 1 和 hBD 3 可以提高表皮角质细胞紧密连接蛋白表达量 降低细胞通透性 24 饲喂抗菌肽 BF 可以提高断奶仔猪肠道紧密连接蛋白 occludin claudin 1 和 ZO 1 的表达量 保护小肠肠道黏膜的完 整性 25 刘倚帆 26 发现蛇源 Cathelicidin BF C BF 可以通过 MAPK 信号通路提高猪空肠上皮细胞 IPEC J2 紧密连接蛋白 ZO 1 occuludin 的表达量 保护机体肠道屏障结构的完整性 此外 注射富含脯氨酸精 氨酸的 39 位氨基酸抗菌 PR 39 能显著缓解沙门氏菌侵染及葡聚糖硫酸钠 DSS 诱导造成的小鼠肠道 屏障功能受损 维护肠道结构完整性 而某些抗菌肽对上皮细胞的作用正好相反 如蜂毒素可以在短时间 内打开细胞间的紧密连接 使得细胞通透性突然增加 27 2抗菌肽与抗生素的互作效应 一些抗菌肽与抗生素间存在互作效应 刘倚帆 26 研究了抗菌肽与抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳 性菌的体外协同抗菌效果 结果表明 牛乳铁蛋白肽 LFcin B 天蚕素 A Cecropin A 与金霉素对革兰氏阴 性菌及阳性菌均具有协同作用 PG 1 和 C BF 与金霉素和新霉素联用对大肠杆菌 EPEC O78 K80 有协同作 用 国内外研究学者也报道了多种抗菌肽与抗生素之间的互作效应 如 Westerhoff 等 28 研究表明 来源于 非洲爪蟾的抗菌肽 magainina 2 和 PGLa 具有协同作用 Vorland 等 29 发现红霉素和 LFcin B 联合使用对大 肠杆菌具有协同抗菌作用 保育猪和断奶仔猪生长性能的试验也验证了抗菌肽与抗生素的互作效应 30 31 另有研究发现抗菌肽 RSPR 与硫酸链霉素 乳酸甲氧嘧啶 恩诺沙星联合应用都表现出拮抗效应 32 3抗菌肽的稳定性和吸收 目前 国内外研究者对于抗菌肽的生物活性 作用机制等研究已较深入 而真正能转化为产品的抗菌 肽却寥寥无几 且基本是用于局部治疗 究其原因 主要是由于天然抗菌肽的稳定性及利用效率不理想 虽然部分抗菌肽在体外具有耐高温 耐酸碱 耐反复冻融等特性 33 但是研究学者普遍认为抗菌肽在体内 的稳定性非常差 因为抗菌肽作为肽类物质 极易被体液中的多种蛋白酶降解而失去活性 尤其是经口服 时 消化道中大量的胃蛋白酶 胰蛋白酶等可以轻易降解肽类物质 如 LL 37 与胰蛋白酶混合孵育 6 h 会 被完全降解失去活性 34 近年来 研究者们提出诸多改善抗菌肽稳定性的方法 如 Carmona 等 35 利用 D 氨基酸替代抗菌肽 Pin2 固有的 L 氨基酸后 其抗菌活性基本没有改变 而 D Pin2 能够在血清 胰蛋白酶 等环境下仍然保持抗菌活性 在提高稳定性的同时 抗菌肽的利用效率问题也应该受到重视 目前 关于抗菌肽经口服后在消化道 停留的时间 是否能通过肠道吸收等问题还鲜有报道 此外 若抗菌肽被吸收或经注射入血 其在体内代 谢情况的研究也较少 王升兰等 36 测定了不同时间点抗菌肽 S sanatian 在动物体内的血药浓度变化 分析 其在大鼠体内的半衰期为 1 5 h 左右 4 抗菌肽的表达规律与营养调控 4 1 动物体抗菌肽表达规律 抗菌肽在动物体内的表达存在品种差异和组织特异性 Gao 等 37 比较了抗病力不同的地方品种莱芜猪 荣昌猪和藏猪 以及外来品种长白猪体内的 Cathelicidin 抗菌肽 PR 39 的品种与组织表达差异 结果表明 地方品种猪 PR 39 基因表达量总体上高于长白猪 骨髓是猪 PR 39 基因表达的主要部位 Chen 等 38 研究 发现猪 防御素 1 pBD 1 猪 防御素 2 pBD 2 猪 防御素 3 pBD 3 在梅山猪大部分的组织 中表达水平高于杜长大猪 Qi 等 39 研究发现 pBD 1 pBD 3 在藏猪组织表达水平也普遍高于杜长大猪 Ma 等 40 研究显示 cathelicidins 家族抗菌肽 PMAP 23 PMAP 37 PR 39 和 protegrin 1 在民猪大多数组织中 表达水平高于长白猪 且在胸腺 脾 肝 心脏组织中高表达 在回肠 空肠 舌头 淋巴结中低表达 同时本课题组也研究了不同日龄金华猪和长白猪肠道 防御素家族的表达规律 发现仔猪肠道 pBD 1 和 pBD 3 基因表达随日龄增加呈上升趋势 且 20 40 和 60 日龄金华猪肠道 pBD 1 pBD 2 pBD 3 的表 达水平均高于长白猪 41 4 2 外源致病因子对抗菌肽分泌表达的影响 抗菌肽是先天免疫重要效应分子 当外来细菌侵染的时候 机体分泌表达抗菌肽发挥相应的免疫调节 作用 如小鼠感染 K pneumoniae 后肠道 CRAMP 表达显著增加 42 Wu 等 43 报道鼠伤寒沙门氏菌能提高猪 骨髓细胞 PR 39 和 protegrin 的基因和蛋白表达 Veldhuizen 等 44 也发现鼠伤寒沙门氏菌能特异性地上调猪 结肠上皮细胞系 pBD 1 和 pBD 2 的基因表达 而霍乱沙门氏菌则不能引起抗菌肽的表达变化 本课题组研 究表明 大肠杆菌 K88 攻毒能提高金华猪和长白猪骨髓 脾脏 回肠中 PR 39 基因表达水平 37 4 3 抗菌肽的营养调控 通过营养手段调控内源抗菌肽的表达 是一种较为有效的方法 其中维生素 D3和丁酸是最主要的手 段 维生素 D3可诱导多种细胞抗菌肽的表达 45 47 此外 锌 多糖和益生菌等也发挥调控作用 汪以真 等 48 研究表明 硫酸锌 100 mg kg 和纳米氧化锌 100 mg kg 对猪 PR 39 的表达水平无显著影响 而 高浓度氧化锌 3 000 mg kg 能显著提高猪 PR 39 的表达水平 378 26 饲粮中添加细菌多糖能提高骨 髓和肝脏中 PR 39 以及肝脏中 Hepcidin 的表达水平 49 其他学者研究表明 精氨酸和异亮氨酸等可以诱导人上皮细胞 防御素的表达 50 52 维生素 A 的代谢 产物视黄酸可诱导猪 PR 39 的表达 43 综上所述 以营养调控的方式促进内源抗菌肽的表达在目前更适合 抗菌肽在畜牧生产中的应用 然而 这仍有赖于对抗菌肽表达调控机制更深入的研究 5抗菌肽的分子设计与改良 为了获得抗菌活性高 细胞毒性低 稳定性好的抗菌肽 将模板肽通过分子改良的方法被广泛应用 抗菌肽的分子改良主要依据其构效关系实施 这是设计抗菌肽所遵循的最基本原则 国内外普遍采用的 改良方法主要包括 1 将 2 种不同源肽活性片段进行分子嵌合 形成杂合肽 53 2 通过氨基酸替换 二硫键删除的方式将天然肽进行分子改造 54 3 对天然肽截取活性片段以提高抗菌功能 55 4 通过肽 文库与计算机模拟进行高通量筛选 56 Liu 等 57 采用分子杂合的方法构建了具有 发夹结构的杂合肽 LB PG 和 CA PG 研究结果表明获得 的杂合肽不仅安全性好 抗菌谱广 且具有缓解炎症的功能 此外通过氨基酸替换的方式对乳铁蛋白肽 LFP 20 进行改良 获得的改良肽 LF 6 具有更高的抗菌活性与低的真核细胞毒性 另外 Dong 等 58 通过将天然抗菌肽截取的方式提高了禽 防御素 4 的抗菌活性 同时降低了其溶血毒 性 其还将具有广谱抗菌活性的 RR7 片段与抗细菌生物膜活性的 FV7 片段进行分子嵌合 获得兼具两者 优势的杂合肽 R FV I16 59 6 抗菌肽的重组表达 基因重组表达的方法可能是目前最经济的获得大量抗菌肽的手段 但是 由于抗菌肽极易受到蛋白酶 的攻击 且表达产物往往对宿主细胞有毒性 因此 抗菌肽的外源表达较其他多肽类药物更为困难 为了 克服以上难题 研究者探索出众多表达策略 涉及的表达系统主要有大肠杆菌和酵母表达系统 大肠杆菌 表达系统具有遗传背景稳定 成本低 周期短的优点 但难以表达结构较为复杂的抗菌肽 而酵母表达系 统虽然能够直接表达多种抗菌肽 但是其表达成本较高 产量较低 通过将目的肽与分子伴侣融合表达可 有效解决抗菌肽对宿主菌的毒性以及易被蛋白水解酶降解的问题 常用的分子伴侣有硫氧还蛋白 thioredoxin Trx 60 谷胱甘肽转移酶 glutathione S transferase GST 61 泛素相关小修饰蛋白 small ubiquitin like modifier SUMO 62 等 Bi 等 63 在大肠杆菌 BL21 中融合表达了杂合肽 LfcinB 1 15 Melittin 5 12 纯化后产量达到 35 mg L 培养液 同时其利用毕赤酵母表达系统高产表达了鸟的防御素 Avian defensin 6 产量达到了 114 9 mg L 培养液 64 Chen 等 65 利用 SUMO 融合表达技术在枯草芽孢杆 菌表达系统中成功表达了天蚕素 Cecropin AD 纯化后产量为 30 6 mg L 培养液 Luan 等 66 通过比较不同 分子伴侣 不同诱导温度 时间等条件 利用 SUMO 融合表达技术在枯草芽孢杆菌表达系统中成功表达了 蛇源抗菌肽 C BF 7小结与展望 在抗生素滥用导致耐药细菌产生 药物残留以及环境污染的今天 抗菌肽的研究无疑为解决这些 问题带来了希望 然而 真正把抗菌肽应用于养殖业目前仍面临着许多挑战 首先是抗菌肽的来源问 题 天然肽含量低 分离纯化困难 化学合成成本高 重组表达得率低 其次是抗菌肽的活性问题 与抗生素相比 杀菌能力偏弱 抗菌谱偏窄 而且不同肽在抗菌或免疫调节功能上各有侧重 不能统 一标准 再次是抗菌肽的体内稳定性问题 对胃蛋白酶和胰蛋白酶的敏感让口服或饮水等给药方式受 到限制 而对血清和金属离子的敏感亦让注射给药受到约束 另外还有抗菌肽的毒性问题 由于其在 体内的吸收代谢机制不甚明了 其潜在的毒性如局部过敏反应 溶血作用等都不容忽视 最后是抗菌 肽的耐药性问题 虽然其膜作用机制不存在抗生素样的耐药性 但由于应激反应触发的病原性免疫进 化而导致的耐药性仍然存在 随着抗菌肽研究的不断深入以及生物技术的发展 相信突破抗菌肽走向养殖业的技术壁垒将变为可能 通过构建合适的表达系统 完善表达策略将获得大量成本低 产量大 活性高的重组抗菌肽 通过基因改 造 人工修饰等途径将最大限度地提升抗菌肽的抗菌功能 运用酰胺化 环化 D 氨基酸替代 包被等方 法将提高抗菌肽在体内的稳定性和安全性 深入探讨抗菌肽的药代动力学将进一步挖掘抗菌肽在体内发挥 作用的机制 以上研究将会为研发高效安全的抗菌肽制剂提供重要基础 参考文献 1 YEAMAN M R YOUNT N Y Unifying themes in host defence effector polypeptides J Nature Reviews Microbiology 2007 5 9 727 740 2 LI Y M XIANG Q ZHANG Q H et al Overview on the recent study of antimicrobial peptides origins functions relative mechanisms and application J Peptides 2012 37 2 207 215 3 YOUNT N Y YEAMAN M R Immunocontinuum perspectives in antimicrobial peptide mechanisms of action and resistance J Protein and Peptide Letters 2005 12 1 49