中医实验研究的思路教学材料

中医实验研究的思路教学材料 第二章第二节中医实验研究的思路 一、中医实验研究的目的与意义首先，第一自然段，讲定义，讲目的。 介绍了为什么中医要引入实验方法（弥补临床观察、直觉领悟之不足等等）。 “基础研究优点1）通常可以提示什么可能发生；2）从可控的实验室情境中得出的结果往往比现实生活中的更有说服力。 （B.H.坎特威茨等.实验心理学,25）背景中医药对疾病治疗的疗效，需要比较、评价、发展、提高。 如何实现？动物实验是主要手段之一。 中医临床特点是辨证论治。 “同病异治”、“异病同治”。 自然地要求实验动物，以及动物实验中开展辨证论治。 问题是动物如何辨证论治，首先是动物有没有证候，如何采集其证候。 诚如教材撰写所言，在撰写该教材的时候（1998-1999），中医学术界尚不能对小鼠等实验动物，开展辨证论治。 当时对疾病动物证候的判断，主要采取三种方式1）以方测证。 2）微观辨证（即引用临床或实验发现的与证候有关的实验室检测指标）。 3）疾病、证候叠加造模。 在取得积极进展的同时，其局限性妨碍了其推广与应用。 通过我们多年的探索，小鼠参见虚证的四诊和辨证方法基本建立。 我们以后会介绍。 材料和方法1实验动物与造模KM品系小鼠，雄性，120只，17-24g，清洁级条件下常规饲养。 随机取10只作为正常对照，其余腹水传代肝癌H22细胞右腋下接种0.2ml（含瘤细胞数8106个）。 2实验分组及用药接种后第5天选出瘤体大小适中小鼠90只（其余淘汰），随机分组分为10组，每组小鼠10只正常组对照主（甲）、模型对照组（乙）、不同中药复方组8个，国内公开报道的处方（处方与出处不宜公开），分别标记为丙、丁、戊、己、庚、辛、壬、癸。 并于当天用药。 中药采用标准水煎醇沉工艺，剂量为正常成人每公斤体重的10倍。 每组小鼠每日灌胃0.5ml，正常组及模型组灌等量自来水。 常规饲养。 3小鼠四诊检测指标及方法标准采集 （1）体重 （2）腋温（） （3）爪和尾显微数码拍照（计算机图像处理，提取反映红色程度的r值） （4）晚间35s旷场自主活动计数（跨格数的水平移动、前肢离地数的垂直移动） （5）瘤体积（cm，计算公式abb/2，a代表肿瘤的长径，b代表肿瘤的短径） （6）估算瘤重（g，瘤重=瘤体积） （7）生存时间结果1不同组别荷瘤小鼠生存情况0%20%40%60%80%100%120%1d7d13d19d25d31d接种后天数生存率乙丙丁戊己庚辛壬癸图2所有荷瘤小鼠生存情况0246810127d14d18d21d25d28d32d接种后天数瘤体积（cm3)瘤体积283338434853587d14d18d21d25d28d32d接种后天数体重（g）正常体重荷瘤体重去瘤体重2荷瘤小鼠不同阶段四诊的演变 （1）总体上，荷瘤小鼠肿瘤体积呈持续增长；去瘤体重呈抛物线状，中晚期增长平缓）。 图3所有荷瘤小鼠估算瘤重（g）增长情况图4所有荷瘤小鼠体重（g）增长情况以上分别反映什么证候？0246810121416187d14d18d21d25d28d32d接种后天数活动度正常水平荷瘤水平正常垂直荷瘤垂直3333.53434.53535.53636.53737.53838.57d14d18d21d25d28d32d接种后天数腋温（）正常腋温荷瘤腋温 （2）荷瘤小鼠好奇和自主活动持续下降。 旷场检测小鼠水平和垂直运动减少。 （3）荷瘤小鼠腋温持续下降，下降幅度大，严重时降幅达9%！图5所有荷瘤小鼠旷场活动情况图6所有荷瘤小鼠腋温（）改变情况以上分别反映什么证候？ （4）荷瘤小鼠爪、尾颜色变淡，反映红色程度的r值下降。 其中，爪r的变化显著，严重时降幅达9.2%！0.380.390.40.410.420.430.440.450.467d14d18d21d25d28d32d接种后天数r值正常爪r荷瘤爪r正常尾r荷瘤尾r图7所有荷瘤小鼠爪、尾r值演变情况以上反映什么证候？3荷瘤小鼠不同阶段证候的演变方法各证型权重、辨证阈值及称谓痰瘀邪盛=各小鼠瘤重/所有小鼠瘤重均数。 大于1.5为邪毒甚，大于2为邪毒壅盛；小于0.75为邪较弱；0.5为邪弱。 阴虚程度=各小鼠正常或去瘤体重/正常组体重均值。 小于0.9为阴偏虚，小于0.8为阴虚。 气虚程度=各小鼠水平移动数/正常均数0.6+各小鼠垂直移动数/正常均数0.4。 大于1.5为气盛，小于0.5为气虚。 阳热程度=各小鼠校正腋温/正常均数0.3+各小鼠爪校正r/正常爪r均数0.5+各小鼠尾校正r/正常尾r均数0.2。 大于1.02为阳偏盛，小于0.98阳偏虚，小于0.95阳虚。 阳气程度=气虚程度0.2+阳虚程度0.8。 大于1.1为阳气盛，小于0.85为阳气虚。 结果如下 （1）邪毒证候盛衰的演变肿瘤增长的快慢标志着邪毒的盛衰。 荷瘤小鼠肿瘤增长迅速者早期偏多，以后逐渐减少；肿瘤增长缓慢者所占比例逐渐增加，可能与存活时间较长的小鼠肿瘤细胞增生不活跃和体质较好有关。 0%10%20%30%40%50%60%7d14d18d21d25d28d32d接种后天数比例（）邪毒壅盛邪毒盛居中邪偏弱邪弱图8所有荷瘤小鼠肿瘤大小分布与演变0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%7d14d18d21d25d28d32d接种后天数比例(%)阴虚气盛气虚阳偏盛阳虚阳气盛阳气虚00.20.40.60.811.27d14d18d21d25d28d32d接种后天数程度正常阴虚程度气虚程度阳热程度阳气程度 （2）不同虚证的发生及演变与人类类似，随着病情的发展，荷瘤小鼠虚证出现的频率增加（为简捷明了，合并阴虚含阴偏虚、阳虚含阳偏虚、阳气虚含阳气偏虚）从不同虚证的程度看，气虚的程度最严重，其次是阳气虚。 阳热下降恒定，但幅度小，阴虚则不一致，推测与实验后期所存活动物体质相对较好有关图9所有荷瘤小鼠合并虚证的分布与演变图10所有荷瘤小鼠阴、阳、气虚演变情况研究发现1）接种后的第7天，证候以邪毒为主，虚证无证可辨接近半数，虚证以单证居多。 2）接种后的第14天。 总体进入中期，邪毒已不是重点，肿瘤体积居中的增加，并保持下去。 阴虚和偏阴虚占16，明显增加；气虚比例也显著上升；阳偏虚、阳虚的比例大幅上升，并均保持下去。 对于阳虚如此高发，以往未见报道，可能是小鼠的特点。 该阶段死亡以阳气虚为主要原因，因此，扶持阳气十分必要。 此时阴虚多为气阴两虚、阴阳两虚，仅1例为单纯阴虚。 3）第18天，邪毒大多不甚；阳虚比例下降，可能与剩余动物体质较好有关；该阶段，单纯阴虚出现3例，有所增加。 4）第21天，该阶段小鼠出现大量死亡，集中在阳气虚、阴阳两虚。 由于阳虚普遍发生，已无单纯的阴虚。 5）第25天，已进入晚期，该阶段小鼠出现大量死亡，集中在阳气虚、阴阳两虚。 6）第28天，该阶段小鼠出现大量死亡，集中在阳气虚。 提示，晚期保护阳气的重要性。 7）第32天，阳虚减少，而阳气虚增加，提示气虚程度的严重。 （3）兼证及其演变与人类类似，随着病情的发展，荷瘤小鼠虚证兼证的比例增加。 趋势是无证可辨的数量和比例下降，单证的数量和比例下降；两证组合变化不大；而三个兼证组合者显著增加，四诊组合从无到有，有增加趋势0102030405060707d14d18d21d25d28d32d接种后天数比例无证可辨单证两证组合三证组合四证组合图11不同时期荷瘤小鼠证候比例的演变4荷瘤小鼠的预后是否能在荷瘤小鼠出瘤的早期，依据其证候或体质，判断其预后？方法求出同一日死亡小鼠不同证候的权重平均值，与生存天数比较。 采用SPSS11.5统计软件进行相关分析。 结果 （1）痰瘀邪盛程度与预后的相关系数为-0.539，P=0.01，具有统计意义，提示荷瘤小鼠早期肿瘤增长迅速者，预后差。 生存天数30xx0邪毒程度2.52.01.51.0.50.0图12痰瘀邪盛证候程度与预后的关系生存天数30xx0阴虚程度1.21.11.0.9.8生存天数30xx0气虚程度2.52.01.51.0.50.0 （2）阴虚程度与预后的相关系数为-0.316，P=0.15，提示早期阴盛（体重较重者）预后不佳。 （3）气虚程度与预后的相关系数为0.275，P=0.21，提示早期气虚程度严重者，预后较差。 图13阴虚证候程度与预后的关系图14气虚证候程度与预后的关系生存天数30xx0阳热程度1.021.011.00.99.98生存天数30xx0阳气程度1.31.21.11.0.9.8.7 （4）阳热程度与预后的相关系数为0.236，P=0.29，提示早期阳热虚程度严重者，预后较差。 （5）阳气虚程度与预后的相关系数为0.287，P=0.19，提示早期阳气虚程度严重者，预后较差。 图15阳热证候程度与预后的关系图16阳气虚证候程度与预后的关系从以上结果可见1）早期肿瘤增长迅速，体积大，邪毒壅盛者，预后不良。 这是决定预后的主要原因。 2）早期气盛略优于气虚，阳气盛略优于阳气虚。 此外，我们还观察到3）实验中，腋温下降、体重持平和下降是预后差的重要标志。 一旦腋温或体重下降，多濒临死亡。 与阳气衰竭、阴虚液脱类似。 总之，痰瘀邪盛证候与预后的关系最为密切，痰瘀邪盛证候越重，其生存期越短。 其次与预后有关的证候依照密切程度为阳气虚、气虚、阳热。 5不同处方疗效的比较依据荷瘤小鼠虚证复杂和严重程度，以及生存天数，总体上癸、己、庚、辛等4张处方疗效较好，而丙、丁、戊、壬4张处方疗效较差。 那么以上疗效的取得，单纯取决于处方，还是由于分组偏倚，尤其是那些早期邪毒壅盛证候的小鼠分配到那些疗效不好的组别中所造成的？我们把疗效较差的丙、丁、戊、壬4张处方组别合并，把疗效较好的癸、己、庚、辛等4张处方组别合并，与模型和正常对照。 结果如下 （1）邪毒壅盛程度疗效较差的4个组别，早期肿瘤邪毒壅盛，因而其疗效差异的主要原因可能是分组偏倚所造成的。 鉴于第一次检查是在用药后第2天，所以其差异可能还与不同处方疗效有一定的联系。 0.60.70.80.911.11.21.31.47d14d18d21d25d28d32d接种后天数邪毒壅盛程度模型丙丁戊壬己庚辛癸图17疗效优劣组别肿瘤邪毒盛衰的演变0.80.850.90.9511.051.11.157d14d18d21d25d28d32d接种后天数阴虚程度正常模型丙丁戊壬己庚辛癸00.20.40.60.811.27d14d18d21d25d28d32d接种后天数气虚程度正常模型丙丁戊壬己庚辛癸 （2）阴虚、气虚、阳热、阳气程度早期不同组别的阴虚、气虚、阳热、阳气程度类似，以后逐渐有了差别。 这种差别可能是肿瘤自然发生的，也可能受到了药物影响。 图18疗效优劣组别阴虚程度的演变图19疗效优劣组别气虚程度的演变0.90.920.940.960.9811.027d14d18d21d25d28d32d接种后天数阳热程度正常模型丙丁戊壬己庚辛癸0.650.70.750.80.850.90.9511.057d14d18d21d25d28d32d接种后天数阳气程度正常模型丙丁戊壬己庚辛癸图20疗效优劣组别阳热程度的演变图21疗效优劣组别阳气盛衰程度的演变讨论与结论1关于计量检测指标的充分与否本研究所选择的计量四诊检测指标很有限。 鉴于中医临证的特点是通过望闻问切采集四诊指标，方便、实用、经济、有效，鉴此，如何进一步探索和发展小鼠四诊检测指标，重在实用和有效，是我们今后努力的方向。 同时，抓住一些关键指标是可以研究的。 这样的实例国际上也有。 例如“使用心率、瞳孔扩大和大脑波形等指标，就能帮助认知心理学家研究一些基本特征。 （B.H.坎特威茨等.实验心理学,568）结论在研究手段限制下、不完美下，还是需要开展研究，在研究中发展方法。 2关于证型的命名和权重计算 （1）中医学通常把肿瘤病机归结为痰瘀毒。 邪毒盛则增长迅速，因此依据肿瘤体积大小，划分为邪毒壅盛（为所有肿瘤体积均数的2倍）、邪毒甚（1.5倍）、居中，邪较弱（0.75倍）和邪弱（0.5倍），反映邪气盛衰。 （2）阴虚主要表现为形质减少，例如消瘦、脉细、剥苔等，一旦兼见气虚、阳虚，热象往往不显著。 鉴此，我们把正常或去瘤体重/正常组体重均值，小于0.9计为阴偏虚，小于0.8计为阴虚。 （3）气虚的重要标志是乏力，突出表现为运动减少。 小鼠旷场移动是很好的检测方法。 在旷场中，小鼠表现为水平移动，以及直立两种主要运动方式。 相比之下，水平移动区域广，差别大。 因此我们取各小鼠水平移动格数/正常移动均数0.6+各小鼠抬头起立数/正常均数0.4，与正常组均数相比，大于1.5计为气盛，小于0.5计为气虚。 （4）阳热盛衰的重要标志包括体温和体表颜色，阳热盛往往表现为体表温度高、面红目赤。 从小鼠爪、尾标准摄像中，可以提取反映红色程度的r值，r值愈高表示爪愈红。 鉴于小鼠腋温波动较大，以及爪反映红色的程度和灵敏度优于尾，我们采用各样本校正腋温/正常均数0.3+各样本爪校正r/正常爪r均数0.5+各样本尾校正r/正常尾r均数0.2的运算公式，求出各小鼠的阳热指数，并依据数据分布，初步设定为大于1.02为阳偏盛，小于0.98阳偏虚，小于0.95阳虚。 （5）阳气集中代表了气和阳的综合特征。 鉴于小鼠旷场移动频率波动较大，我们采用气虚程度0.2+阳虚程度0.8来综合反映阳气盛衰程度，与正常组均数相比，大于1.1为阳气盛，小于0.85为阳气虚。 以上证候阈值的确定，参照临床特点和实测数据分析后作出的。 至于如何验证和获得最佳阈值，需要大量的实验验证。 但是，作为统一的标准，这样的阈值对所有小鼠是一致的，因而是可以比较的。 3本项目的意义 （1）在小鼠证候采集中，首次采用了标准化的四诊检测技术，所有指标实现了计量化、标准化、客观化；小鼠证候的严重程度实现了量化描述；该方法的建立有助于疗效评价。 （2）所有小鼠的辨证采用了统一的标准，计算机计量辨证，避免了人工辨证带来的误差。 （3）客观揭示了荷瘤小鼠与人类类似，证候及其兼证会逐渐增加，日渐严重，因此可以很好地模拟临床肿瘤证候的演变，用于病证结合研究。 （4）采用疾病模型，通过非创伤性的四诊手段，观察疾病状态下证候的自然发生及其演变，从而可以避免以方测证、微观辨证、病证叠加造模等方法的局限，为中医药病证结合和辨证论治的基础研究提供了方法学，具有重要的学术意义和应用价值。 回到教材前面介绍了为什么中医要引入实验方法（弥补临床观察、直觉领悟之不足等等）。 “基础研究优点1）通常可以提示什么可能发生；2）从可控的实验室情境中得出的结果往往比现实生活中的更有说服力。 （B.H.坎特威茨等.实验心理学,25）是不是这样？与当代西医相比，中医学的特点，以及发展趋势。 方法是根据中医药的特点把生命科学研究方法与技术引入中医药领域。 中西医必须沟通，中医要现代化。 中医药的实验研究是实现这一目标的重要措施。 目的是传统医学和现代科学融合、渗透、取长补短。 发展自身，且充实和深化世界医学人类共同的财富。 进一步解释了中西医的共性和个性，全面地看问题、分析问题。 注意，有一种倾向，把古代的中医与当代的西医比，把古代的中医与当代的中医比。 这样是否合理？再次，最后自然段讲了中医目前的优势，以及实验研究的切入点和方向。 关于“生物-心理-社会”医学模式与中医的优势问题。 中医药是否存在优势？关于综合-分析-综合的方法问题。 二、中医实验研究的发展该节简要介绍了中医实验研究若干事例灵枢关于解剖的记载。 难经对五脏的形状，重量，容积，长度的详细描述。 唐代陈藏器本草拾遗赤铜屑治疗折疡，焊骨的六畜实验描述。 宋证类本草白米饲养马和犬引起脚气病。 还有那些古代实验记录？同时代的西医在干什么？课后请大家上网和借阅不同版本的中医和西医医学史。 1923年陈克恢等在中药药理研究中采用动物实验研究麻黄和当归。 五十年代开始的针灸经络研究。 六十年代开始的中医证候动物模型研究，上海邝安坤1963阳虚小鼠证候模型。 七十年代后期证候动物模型迅速发展。 还有那些代表性的实验研究？大家关心的话，可以检索有关文献。 三、中医实验研究的思路本节的论述重点放在思路，与后面比较具体的介绍要求不一样。 所以，在学习上，要求也不一样。 可能的话，以后可以反复看几遍。 （一）实验研究的选题、设计与分析总结1选题“选题应结合社会需要，瞄准国际前沿，充分发挥中医优势，突出创新”。 这点很重要。 社会需要什么，国际前沿在哪，中医优势是什么？如何了解？二战期间，心理学家受雇于不同行业，例如研究公共意见和宣传，帮助协调海陆空三军的关系，为人员选拔设计测验，等等，心理学家被迫从纯研究中出来，将其知识用于身边各种各样问题中。 由此使他们发现不足，提供发展思想的机会，因此，二战对心理学的许多领域都产生了健康的影响。 人类工程学作为学科就是这样产生的。 （B.H.坎特威茨等.实验心理学,566）贝尔实验室也有这样的经验。 在满足政府的需求中，得到支持和发展，开拓新的领域。 有人比较了不同的汽车刹车灯，结果发现“中央高位”刹车灯可以较一般位置的减少事故54，破坏程度下降38。 结果目前被普遍采纳。 但是后续的研究发现没有那么好，是什么原因呢？（B.H.坎特威茨等.实验心理学,545）如何创新？以衰老和延缓衰老为例。 目前国际上限制饮食、激素（性激素、生长激素等）替代疗法、专业人员指导下的锻炼，等等。 优点和缺点。 中医药的情况。 教材上举例 （1）临床选择西医办法较少，而中医办法、疗效较好的常见病；以及重视继承发掘老中医的临床经验。 （2）基础找一些与现代医学提法不同的，而中医临床行之有效的，具有创新性和发展前景的课题进行研究，同时要根据国内外研究现状和本单位的中医优势和条件从中寻找突破口。 （3）从病证结合以病带证或以证带病着手进行中医证和病机的研究是一个重要的突破口。 （4）有的专家认为藏象容易取得成就。 （5）复方研究。 （6）中医体质学说。 以上1-3讲方向；4-6讲具体内容。 反映了目前中医学术界的一些共识、方向、热点。 2实验设计第1自然段提到了工作假设；遵循“重复、对照、随机”等基本科研规律；密切结合中医理论和临床特点等3个方面。 第2-3自然段讲临床实验设计病证结合方式，中西医诊断和辨证标准，合理的对照（包括同病无证者、同病同证者、药物验证组等）。 为什么？第4自然段讲实验设计与结果分析要合理、客观、中肯。 第5自然段讲中医实验研究是传统医学和当代高新科技相结合的过程。 要突“拿来主义”，吸收一切先进理论和科技手段。 尤其是西医学。 以下两个自然段举例说明。 最后，提到了实验观察指标要具有代表性、先进性和可行性。 各指标间要有内在联系。 并举例。 3实验结果的分析与总结主要介绍实验设计合理；实验条件、误差控制；实验数据统计处理；、判断和推理；参考国内外动态。 因之严格而周密的科研设计，可靠的实验方法和正确的数据统计是获得正确分析结果的基本保证。 并举例。 （二）临床实验研究定义临床实验研究以病人为研究对象，通过严格的科研设计，控制条件，对志愿者进行无损伤性实验室测试，并对其出现的现象进行观察、记录和分析，作出推断或结论。 局限难以开展深层次的机理研究。 但是在临床疗效评估和理论验证方面，临床实验是不可缺少的阶段。 重要性细致的临床观察是中医传统特色，目前还不能为其他方法所取代。 对基础实验研究的贡献和举例。 （内容精彩）（三）动物实验研究定义动物实验是用动物来进行生命科学的实验研究。 意义可以开展损伤性检查，是医学、生命科学研究不可缺少的手段。 限制动物没有主诉、动物辨证困难。 重点介绍动物模型1以中医病因病机为依据复制动物模型 （1）根据病因造成的病理模型。 这种方法的指导思想是，虽然证的现代病理生理变化尚不清楚，但可以假定施以同种病因会引起同样或类似的病理改变。 包括六淫的动物模型、七情的动物模型。 （2）根据中医病机造成的模型。 各种致病因素作用于人体所引起的疾病发生发展与变化的机理称病机。 以中医病机为依据可造成气虚、血虚、脾虚、血瘀等动物模型。 2根据病证结合，有病必有证，选择某些西医病理模型作为中医证的模型3根据证的现代病生机理复制病理模型如微循环障碍是血瘀病理变化的重要标志，故采用高分子右旋糖