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文档简介

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测。主要试剂1、LB培养基。2、100mM IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22m滤膜抽滤，-20保存。操作步骤1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamH和Hiind），PCR循环获得所需基因片段。PCR反应体系为：模板（含R基因的重组质粒）1l上游引物PR11l下游引物1ldNTP（2.5mmol/L）5l10PCR buffer（含Mg2+）10lTaq酶1lddH2O补至100lPCR反应条件为：94变性 3min；94变性 3min、52复性40sec、72延伸1min，30个循环；最后72延伸8min。2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为：pRSETA1lR基因片段3lT4 DNA连接酶（5U/l）1l5buffer2lddH2O补至10l3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50g/ml）中37过夜培养。2、按1100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37震荡培养至OD6000.5-0.8（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续于37、200rpm震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml,，离心12000g30s收获沉淀，用100l 1%SDS重悬，混匀，7010min。5、离心12000g1min，取上清作为样品,可做SDS-PA
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