SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

SDS 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质 一 目的要求1学习电泳原理和技术2学习SDS 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 acrylamide Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺 N N methylene bisacylamide Bis 在加速剂N N N N 四甲基乙二胺 N N N N tetramethylethylenediamine TEMED 和催化剂过硫酸铵 ammoniumpersulfate NH4 2S2O8 AP 或核黄素 ribofavin即vitaminB2 C17H20O6N4 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性 1 在一定浓度时 凝胶透明 有弹性 机械性能好 2 化学性能稳定 与被分离物不起反应 不溶于很多溶剂 3 对pH和温度变化较稳定 4 几乎无吸附和电渗作用 只要Acr纯度高 操作条件一致 则样品分离重复性好 5 样品不易扩散 且用量少 其灵敏度可达10 6g 6 凝胶孔径可调节 根据被分离物的分子量选择合适的浓度 通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径 7 分辨率高 尤其在不连续凝胶电泳中 集浓缩 分子筛和电荷效应为一体 因而较醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖电泳等有更高的分辨率 分子量范围与凝胶浓度的关系蛋白质分子量范围适用的凝胶浓度 10420 301 4 10415 201 5 104 1 10510 151 1055 10 5 1052 5核酸分子量范围 RNA 10415 20104 1055 10105 2 1062 2 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两类 圆盘电泳和板状电泳原理相同 PAGE垂直板电泳示意图 夹心垂直板电泳槽示意图1 样品槽模板2 长玻璃板3 凹形橡胶框4 样品槽模板5 固定螺丝6 上贮槽7 冷凝系统 图3凝胶模示意图 不连续体系 组成 电极缓冲液 浓缩胶及分离胶所 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶 凝胶缓冲液为pH6 7的Tris HC1 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶 凝胶缓冲液为pH8 9Tris HC1 电极缓冲液是pH8 3Tris 甘氨酸缓冲液 2种孔径的凝胶 2种缓冲体系 3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径 pH值 缓冲液离子成分的不连续性 这是样品浓缩的主要因素 凝胶孔径不连续性 在2层凝胶中样品 浓缩胶为大孔径胶 分离胶为小孔径胶 在电场作用下 被分离物在大孔径中移动遇到阻力小 移动速度快 当进入小孔径胶时 被分离物移动受到阻力大 移动速度变慢 因而在两种胶的交界处 由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带 电位梯度的不连续性 在不连续系统中 电位梯度的差异是自动形成的 电泳开始后 由于前导离子的迁移率最大 就会很快超过被分离物 因此在快离子后面 形成一个离子浓度低的区域 这时就有了较高的电位梯度 这种高电位梯度使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快移动 当前导离子 被分离物和尾随离子的移动速度相同时 建立一种稳定状态 这时在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面 这就是样品被浓缩的中间层 压着蛋白质分子聚集到一起 浓缩为一狭窄的区带 1 样品浓缩效应 a 凝胶孔径不连续性 b 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 在pH6 7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子 HC1解离出的氯根 C1 尾随离子 trailingion 或慢离子 甘氨酸根mcl cl mp p mG G Cl代表氯根 P代表蛋白质 G代表甘氨酸根 有效迁移率 m m为迁移率 为解离度 当进入pH8 9的分离胶时 甘氨酸解离度增加 其有效迁移率超过蛋白质 c 电位梯度的不连续性 2 分子筛效应 3 电荷效应 A为电泳前3层凝胶 均有快离子和慢离子 排列顺序B显示电泳开始后 蛋白质样品夹在快 慢离子之间被浓缩成极窄的区带 C显示蛋白质样品分离成数个区带 电泳过程示意图 不连续系统浓缩效应示意图 SDS PAGE 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时 它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素 如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 sodiumdodecylsulfate 简称SDS 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量 而与所带电荷和形状无关 因此可以利用SDS PAGE测定蛋白质分子量 十二烷基磺酸钠 SDS 在可以结合大量的蛋白质分子 1克蛋白结合1 4克SDS 这种带有相同密度的负电荷的SDS 蛋白质复合物 它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量 从而掩盖了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异 由于蛋白质结合SDS后 蛋白质的构象发生了改变 SDS 蛋白质在水溶液中近似长椭圆状 不同复合物短轴一样约为18埃 而长轴随蛋白质分子量成正比变化 因此在进行电泳时 蛋白质的电泳迁移率主要取决于它的分子量 而与所带电荷和形状无关 因此可以利用SDS PAGE测定蛋白质分子量 使用含有十二烷基硫酸钠 SDS 和还原剂 通常为巯基乙醇 的样品处理液对蛋白质样品进行处理 一般煮沸3 5分钟 通过加热和SDS可以使蛋白质变性 多亚基的蛋白质也将解离为单亚基 同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键 使二硫键还原 经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的 分离的状态 由于SDS是带有负电荷的分子 同时它有一个长的疏水尾巴 SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合 结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS 三 试剂与器材 110 SDS 2凝胶贮液 30 ACr 0 8 Bis 3分离胶缓冲液 3 0mol LpH8 9Tris HCl缓冲液 4浓缩胶缓冲液 0 5mol LpH6 7Tris HCl缓冲液 510 过硫酸铵 610 TEMED 7pH8 3Tris Gly电极缓冲液 81 琼脂糖溶液 90 05 考马斯亮兰R250 107 醋酸 试剂 器材 垂直板电泳槽 稳压稳流电泳仪 脱色摇床 五操作方法 1 安装夹心式垂直板电泳槽 1 装上贮槽和固定螺丝销钉 仰放在桌面上 2 将长 短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中 注意勿用手接触灌胶面的玻璃 3 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上 短玻璃板应面对上贮槽 4 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽 双手以对角线的方式旋紧螺丝帽 5 竖直电泳槽 在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1 琼脂 糖 其目的是封住空隙 凝固后的琼脂 糖 中应避免有气泡 30 丙烯酰胺的配制 1 称量Acrylamide290g Bis10g 置于1L烧杯2 烧杯中加入600ml的去离子水 充分搅拌溶解 3 加去离子水将溶液定容至1L 用0 45mm滤膜滤去杂质 4 保存于棕色瓶中 注意 丙烯酰胺具有很强的神经毒性 并可通过皮肤吸收 其作用具有积累性 配制时应戴手套 口罩等 聚丙烯酰胺无毒 但也应谨慎操作 因为有可能含有少量的未聚合成份 3制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液 用细长头的滴管加至长 短玻璃板间的窄缝内 加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm 用1mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水 约3 4mm 用于隔绝空气 使胶面平整 约30 60min凝胶完全聚合 则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线 将上 下贮槽的蒸馏水倒去 将混合均匀后的浓缩胶溶液 用细长头的滴管加到长 短玻璃板的窄缝内 即分离胶上方 距短玻璃上缘0 5cm处 轻轻加入样品槽模板 在上 下贮槽中加入蒸馏水 但不能超过短玻璃板上缘 静置电泳槽 10min左右 上胶即可聚合 再放置10 20min 加入电极缓冲液 使液面没过短玻璃板约0 5cm 轻轻取出样品槽模板 即可加样 分离胶的聚合 12 5ml体系 积层胶的聚合 5 2 5ml体系 4样品的处理及加样 将样品按0 5 1mg mL加样品溶解液 溶解后 将其转移到带塞的小离心管中 轻轻盖上盖子 不要塞紧 以免加热时迸出 在100 沸水浴中加热3min 取出冷却后加样 用微量进样器取25 l上述混合液 通过缓冲液 小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部 5电泳 将电泳仪的正极与下槽连接 负极与上槽连接 接通冷却水 打开电泳仪开关 开始时电流为10mA 待样品进入分离胶后 将电流调至20 30mA 当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时 停止电泳 关闭电源及冷却水 按分子大小分离 小分子 大分子 6染色与脱色 考马斯亮蓝染色电泳结束后 取下凝胶模 卸下硅胶框 用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板 从凝胶板上切下一角作为加样标记 在两侧溴酚蓝染料区带中心 插入细铜丝作为前沿标记 凝胶取出放入培养皿中 加少量的染色液 以浸没凝胶为宜 在摇床上震荡 直到凝胶上出现明显的条带为止 5 6小时或者4 过夜 然后倾去染色液 用脱色液洗涤震荡 其间要不断换脱色液 直至脱色液颜色稍清亮 凝胶背景清楚为止 量出加样端距细铜丝间的距离 cm 和各蛋白质样品区带中心与加样端的距离 cm 计算相对迁移率mR mR 蛋白质样品距加样端迁移距离 cm 溴酚蓝区带中心距加样端距离 cm 7结果处理 在一定的凝胶浓度下 多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系 可以通过标准曲线求未知多肽链分子量 六注意事项 1安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝 避免缓冲液渗漏 2用琼脂 糖 封底及灌胶时不能有气泡 以免电泳时影响电流的通过 3样品中应含一定浓度的蔗糖溶液 目的是用以防止样品因对流而被稀释 4加样时样品不能超出凹形样品槽 加样槽中不能有气泡 如有气泡 可用注