CN102972355A利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法

CN102972355A利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 (10)申请公布号102972355A (43)申请公布日xx.03.xx2972355A*102972355A* (21)申请号xx10518077.9 (22)申请日xx.12.05A01K67/033(xx.01)A01H4/00(xx.01) (71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山路483号 (72)发明人谢辉徐春玲李宇丁莎李克梅 (74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人裘晖苏运贞 (54)发明名称利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 (57)摘要本发明公开了一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法。 本发明通过以下步骤实现新鲜甘薯经洗净、表面消毒、削皮和切片放入培养皿后在培养箱中培养获得甘薯愈伤组织；取经消毒处理的植物寄生线虫接种到甘薯愈伤组织上；分别放在各自适宜温度的培养箱中黑暗培养繁殖；培养一段时间后，将植物寄生线虫连同甘薯愈伤组织于420保存。 本发明方法可实现即简单、大量人工培养繁殖植物寄生线虫，又能长期保存植物寄生线虫资源的目的。 (51)Int.Cl.权利要求书1页说明书5页附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页1/1页21.一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于包括以下步骤 （1）甘薯愈伤组织的制备将新鲜健康的甘薯洗净晾干，用酒精浸泡后，灼烧，至表皮变暗，削去表皮，切成甘薯片，放入灭菌培养皿中，封口，于2228暗培养至长出甘薯愈伤组织； （2）植物寄生线虫的消毒和接种挑取或吸取植物寄生线虫，消毒，然后离心，去除上清，将沉淀的线虫用无菌水混匀继续离心，去除上清，最后将沉淀的线虫用无菌水稀释分散滴在甘薯愈伤组织上，封口； （3）植物寄生线虫的繁殖培养将步骤 （2）中接种了植物寄生线虫的甘薯愈伤组织进行暗培养繁殖，培养温度为植物寄生线虫繁殖的适宜温度； （4）植物寄生线虫的保存将植物寄生线虫连同甘薯愈伤组织于420保存。 2.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （1）中所述的酒精为质量百分比70%的工业酒精；步骤 （1）中所述的浸泡的时间为2min。 3.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （1）中所述的甘薯片厚度为4mm；步骤 （1）中所述的培养皿的直径为6cm；步骤 （1）中所述的封口可用封口膜或者保鲜膜进行封口；步骤 （1）中所述的于2228暗培养至长出甘薯愈伤组织的时间为1015天。 4.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （2）中所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫（Ditylenchusdestructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）或香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）。 5.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （2）中所述的消毒为使用质量百分比0.2%的硫酸链霉素溶液处理312h。 6.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （2）中所述的离心的条件为4000rpm离心2min。 7.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （3）中所述的培养温度具体如下当所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫时，所述的培养温度为2025；当所述的植物寄生线虫为起绒草茎线虫时，所述的培养温度为1720；当所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时，所述的培养温度为2530。 8.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （4）中所述的植物寄生线虫为在甘薯愈伤组织上培养50天的植物寄生线虫。 9.权利要求1所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤 （4）中所述的保存的温度如下所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫或起绒草茎线虫时，所述的保存的温度为4；所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时，所述的保存的温度为20。 10.权利要求19任一项所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，其特征在于包括线虫继代培养的步骤，具体为在接种扩增繁殖线虫的甘薯愈伤组织培养皿中加入无菌水，然后挑出或吸取线虫，重复权利要求1的步骤 （2）和 （3）即可达到继代培养之目的。 权利要求书102972355A21/5页3利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法技术领域0001本发明涉及植物寄生线虫的繁殖培养和保存方法，具体涉及一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法。 背景技术0002对于植物寄生线虫，要研究其系统分类、分子生物学、功能基因组学以及蛋白质组学等基础研究，或者在实验室和田间进行生物学、病理学以及防治方法等基础和应用研究，都需要大量、纯化的线虫。 然而，植物寄生线虫大多都是专性寄生的，很难在纯培养基上培养，只能在相应的寄生植物上繁殖。 在实际中，人们往往利用植物组织培养技术在White （1963）、Krusberg （1961）和Gamborgs B5等植物组织培养基或1水琼脂培养基上，培养新鲜的植物愈伤组织、离体根或其他一些植物器官及整株植物幼苗，然后在这些植物材料上接种培养繁殖植物寄生线虫；兼食真菌的植物线虫，也可以用某些种类的真菌菌丝来培养（冯志新，xx）。 不同类型线虫的培养所采用的具体方法取决于其生物学特性。 0003腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）和香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）都是迁移性内寄生线虫，严重为害多种作物，均被我国列为检疫性植物有害生物。 对腐烂茎线虫和起绒草茎线虫，目前可利用在培养基上培养的紫花苜蓿愈伤组织或真菌进行人工培养繁殖；对香蕉穿孔线虫，则利用在培养基上培养的紫花苜蓿愈伤组织和胡萝卜愈伤组织或利用无培养基的胡萝卜片长出的愈伤组织，进行人工培养繁殖。 但是利用培养基培养植物愈伤组织或真菌，再接种培养繁殖线虫，操作复杂，同时易发生污染导致繁殖成功率和繁殖量低，直接用无培养基的胡萝卜片长出的愈伤组织繁殖和培养保存香蕉穿孔线虫的方法，也因胡萝卜含水量大、易带内生细菌发生腐烂，存在不能长期培养保存等缺陷。 发明内容0004为克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法。 该方法可实现即简单、大量人工培养繁殖线虫，又长期保存线虫资源的目的。 0005本发明的目的通过以下技术方案实现一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，包含以下步骤0006 （1）甘薯愈伤组织的制备将新鲜健康的甘薯洗净晾干，用酒精浸泡后，灼烧，至表皮变暗，削去表皮，切成甘薯片，放入灭菌培养皿中，封口，于2228暗培养至长出甘薯愈伤组织；0007 （2）植物寄生线虫的消毒和接种挑取或吸取植物寄生线虫，消毒，然后离心，去除上清，将沉淀的线虫用无菌水混匀继续离心，去除上清，最后将沉淀的线虫用无菌水稀释分散滴在甘薯愈伤组织上，封口；0008 （3）植物寄生线虫的繁殖培养将步骤 （2）中接种了植物寄生线虫的甘薯愈伤组说明书102972355A32/5页4织进行暗培养繁殖，培养温度为植物寄生线虫繁殖的适宜温度；0009 （4）植物寄生线虫的保存将植物寄生线虫连同甘薯愈伤组织于420保存；0010步骤 （1）中所述的酒精选用工业酒精即可，其浓度优选为质量百分比70%；0011步骤 （1）中所述的浸泡的时间优选为2min；0012步骤 （1）中所述的甘薯片的厚度根据培养皿的厚度，以距离皿盖至少5mm为宜，优选厚度为4mm，太厚靠近皿盖，不易于接种，太薄容易缺失水份，薯块易干，不易于长期培养、繁殖率低；0013步骤 （1）中所述的培养皿可以是多种规格，优选直径为6cm的培养皿；培养皿大太占用空间，太小则只放较小的薯块，不利于提高线虫的繁殖率，此外，6cm的培养皿便于保存；0014步骤 （1）中所述的封口可用封口膜或者保鲜膜进行封口；0015步骤 （1）中所述的暗培养的温度更优选为25；0016步骤 （1）中所述的于2228暗培养至长出甘薯愈伤组织的时间一般为1015天；0017步骤 （2）中所述的植物寄生线虫优选为腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）或香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）；0018步骤 （2）中所述的消毒优选为使用质量百分比0.2%的硫酸链霉素溶液处理312h，可以达到消毒目的，不影响其正常的繁殖发育；0019步骤 （2）中所述的离心的条件优选为4000rpm离心2min；0020步骤 （3）中所述的培养温度要根据被培养繁殖的植物线虫种类的生物学特性确定；因为植物寄生线虫不同属、种间的生物学特性存在差异，最合适的生长温度有所不同；0021当所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫时，所述的培养温度为2025；0022当所述的植物寄生线虫为起绒草茎线虫时，所述的培养温度为1720；0023当所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时，所述的培养温度为2530；0024步骤 （4）中所述的植物寄生线虫优选为在甘薯愈伤组织上培养50天的植物寄生线虫；0025步骤 （4）中所述的保存的温度如下所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫和起绒草茎线虫时，所述的保存的温度为4；所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时，所述的保存的温度为20；0026上述利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，包括线虫继代培养的步骤，是在接种扩繁线虫的甘薯愈伤组织培养皿中加入无菌水，然后挑出或吸取线虫，重复步骤 （2）和 （3）即可达到继代培养之目的。 0027与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果目前，利用甘薯愈伤组织繁殖和培养保存腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）或香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）这3种植物寄生线虫的方法尚未有报道。 本专利发明利用无培养基培养的甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，操作简单、成功率和繁殖率高，并且也可以实现对这3种线虫的更长时间的保存。 本发明的方法既可实现简单、大量繁殖腐烂茎线虫、起绒草茎线虫和香蕉穿孔线虫，又能长期培养保存这些线虫，具体如下说明书102972355A43/5页50028 （1）使用甘薯愈伤组织培养腐烂茎线虫和起绒草茎线虫，与真菌培养方法相比，操作方法更加简便，培养材料更易获得；培养一段时间的线虫比较容易聚集在培养皿底部，容易收集干净的线虫；此外，腐烂茎线虫和起绒草茎线虫属于植物寄生线虫，长期在真菌上培养会导致其对植物寄生和致病力的退化，在甘薯愈伤组织长期培养则能避免此情况发生。 0029 （2）使用无需培养基培养的甘薯愈伤组织培养腐烂茎线虫和起绒草茎线虫，与用培养基培养的苜蓿愈伤组织培养这两种线虫的方法相比，操作步骤简单，对人员操作要求低，省时、省力，且成功率高。 主要表现在1）本发明不需要配制培养基；2）甘薯愈伤组织一般在7天就可以长出，1015天则可以在薯块上长满薯块，但用培养基培养的苜蓿愈伤组织需要1个月；3）甘薯的切片规则，有一个愈伤组织平面，容易接种线虫，而苜蓿愈伤组织不规则，不易接种线虫；4）用培养基培养的苜蓿愈伤组织需要在非常严格的无菌条件下操作，很容易污染，而本发明操作简单，较少发生污染；5）这两种线虫在无培养基培养的甘薯愈伤组织上繁殖率高。 0030 （3）使用甘薯愈伤组织培养香蕉穿孔线虫，与胡萝卜愈伤组织培养香蕉穿孔线虫相比，甘薯相比胡萝卜，含水量较少，较少滋生细菌，甘薯愈伤组织培养成功率高、不易腐烂、能长期培养保存。 胡萝卜含水量较高，内部易感染细菌，很容易在切片消毒后在未长出愈伤组织前出现坏死斑或腐烂，不能用以培养线虫，浪费人力和物力；而培养出的愈伤组织接种香蕉穿孔线虫后，也因含水量较高，而较快腐烂，因此不能在同一块胡萝卜愈伤组织上长期培养保存香蕉穿孔线虫，需要较频繁的将香蕉穿孔线虫转接到新的胡萝卜愈伤组织上进行续培养保存，因此工作量大。 附图说明0031图1是切好的薯片照片图。 0032图2是2周后长出愈伤组织的甘薯薯片照片图。 0033图3是使用甘薯愈伤组织培养腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）50天的甘薯愈伤组织症状照片图，其中培养皿底部箭头所指为腐烂茎线虫聚集形成的白色物质。 0034图4是接种培养腐烂茎线虫50d后放入4冰箱保存1年的甘薯愈伤组织照片图，其中培养皿底部箭头所指为腐烂茎线虫聚集形成的白色物质。 0035图5是接种香蕉穿孔线虫75d后的甘薯愈伤组织症状照片图，其中培养皿底部箭头所指为香蕉穿孔线虫聚集形成的白色网状物。 具体实施方式0036下面结合实施例及附图进一步解释本发明，实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术手段。 0037腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）种群分离自国内感病甘薯（采集地点山东省蒙阴县联城乡季家城子村），公众可从华南农业大学植物线虫研究室获得；参考文献为刘一帆，徐春玲，张超，苏秀敏,谢辉.xx.从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法.中国农业科学，44 (19)3991-3998。 0038起绒草茎线虫（D.dipsaci）种群从进口郁金香上截获的线虫，公众可从华南农业大学植物线虫研究室获得；参考文献为赵立荣，徐春玲，胡学难，钟国强，武目说明书102972355A54/5页6涛.xx.截获的鳞球茎茎线虫的检验鉴定.植物检疫，25 （5）45-47。 0039香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）的种群寄主为红掌（Anthuriumandraeanum），公众可从华南农业大学植物线虫研究室获得；参考文献为刘一帆，徐春玲，张超，苏秀敏,谢辉.xx.从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法.中国农业科学，44 (19)3991-3998。 0040实施例1腐烂茎线虫在甘薯愈伤组织上的繁殖和保存0041具体步骤如下0042 （1）甘薯愈伤组织的制备0043选取健康、比较细长和规则的甘薯薯块（广薯128），洗净晾干；用质量百分比70的酒精浸泡2min，然后在超净工作台中烧掉表面的酒精，用灭菌的削皮刀削去甘薯表皮，然后用刀切成4mm左右的薄片，薄片单个放入无菌培养皿中（图1），用保鲜膜封口，25恒温培养箱中黑暗培养，直至长出愈伤组织备用（一般7d即有愈伤，1015天可长满薯块）（图2）。 0044 （2）腐烂茎线虫的分离0045将有症状甘薯薯块切开，用小刀切取部分有症状的甘薯组织，使用贝曼漏斗法分离线虫谢辉.xx.植物线虫分类学（第二版）.北京高等教育出版社，p38-40。 0046 （3）腐烂茎线虫的消毒和接种0047挑取20条线虫，用挑针挑入装有1ml0.2（质量百分含量）硫酸链霉素的1.5ml Eppendorf管中，消毒3h以上，4000rpm离心2min，去除上清，用无菌水清洗两次，在超净工作台上，去除上清液，吸取离心管中的线虫悬浮液，接种到甘薯愈伤组织表面，用保鲜膜封好，在25条件下培养箱中黑暗培养。 0048 （4）腐烂茎线虫在甘薯愈伤组织上培养一段时间后线虫的收集计数和保存0049将接种腐烂茎线虫的甘薯愈伤组织在培养箱中培养50d（图3），分离线虫或者直接把培养皿放到4冰箱保存备用。 具体分离收集计数方法是腐烂茎线虫线虫培养50d后，首先用清水洗下培养皿及愈伤组织表面的线虫，定容40ml，每次取1ml计算虫及卵量；然后把愈伤组织放入搅拌器中，加入适量的水进行搅拌。 搅拌3次，每次10s，每次间隔5s，然后将搅拌的悬浮液通过100和500目的组合筛，用自来水反复冲洗，再用洗瓶冲洗500目筛上的线虫及卵至小烧杯中，把线虫悬浮液定容40ml，取1ml统计线虫及卵的数量。 重复3次，以3次的平均值作为每个愈伤组织中的虫量，然后以此计算腐烂茎线虫的繁殖倍数。 线虫的繁殖倍数=分离的线虫总量接种线虫量。 005020条腐烂茎线虫接种在甘薯愈伤组织上培养50天后，繁殖的虫量平均为359371537.3条、卵量平均为234671703个，繁于倍数平均达2976168。 由此可以看出用本发明的方法培养腐烂茎线虫，具有极高的繁殖结果。 0051用甘薯愈伤组织培养的接种有腐烂茎线虫的培养皿可以放在4冰箱中保存备用，可以保存半年到1年，保存1年后的腐烂茎线虫（图4）还可以继续接种甘薯愈伤组织，对其进行繁殖培养和保存。 0052实施2起绒草茎线虫在甘薯愈伤组织上的繁殖和保存0053具体步骤如下0054 （1）甘薯愈伤组织的制备见实施例1。 说明书102972355A65/5页70055 （2）起绒草茎线虫的分离0056将有症状的病块根用剪刀剪碎，使用贝曼漏斗法跟病根周围的基质一起分离，方法同实施例1。 0057 （3）起绒草茎线虫消毒、接种培养0058挑取25条雌虫，除接种后培养皿放入18培养箱中培养外，其它消毒和接种方法同实施例1。