酶的固定化技术及其应用综述.docx

酶的固定化技术及其应用曾鸿雁(西南科技大学,四川,绵阳)摘要:随着工业生物技术和酶工程的不断发展，酶在各个领域的广泛应用，对酶的要求也越来越严格。本文针对目前酶工程技术之一酶的固定化，对酶的固定化技术及其展望做一综述。关键词：酶，固定化，技术Immobilization of Enzyme And its ApplicationsAbstract：with the continuous development of biotechnology industrial and enzyme engineering , enzyme are widely used in various fields and the requirements to enzymes also become more and more stringent . This article is to review the enzyme immobilization, which is one of the current enzyme engineering technologiesKey words: enzyme, immobilization, technology一、引言酶是一类具有生物催化性质的高分子物质，其催化性具有专一性强、催化效率高和作用脚尖温和等特点。但是在实际工业生产中，由于实际环境因素，应用酶的过程出现了一些不足之处：酶的催化效率不高。人们在使用酶的过程中，往往要求酶的催化效率要足够高，以加快反应速度，提高劳动生产率，然而实际上很多酶的催化效率不够高而难于满足人们的使用要求。酶的稳定性较差。大多数酶稳定性较差，在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素的影响下，都容易变形失活。酶的一次性使用。酶一般是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混合在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且也难于连续生产。产物的分离纯化比较困难。酶反应后成为杂志与产物混在一起，无疑给产物的进一步分离纯化带来一定的困难。为此，人们开始针对酶的这些不足寻求改善方法，方法之一就是酶的固定化。固定化酶是20世纪60年代开始发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”。但后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍是可溶的。因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”(immobilized enzyme)的名称。所谓固定化酶是指固定在一定载体上并有一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有提高酶的催化效率、增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应物分开的显著优点。二、酶的固定化技术采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程成为酶的固定化（enzyme immobilization）。酶的固定化方法很多，一般有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法。1、 吸附法吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的一种方法。吸附法又可以分为物理吸附法和离子交换吸附法二种。物理吸附法指通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。从而制成固定化酶。其常用的载体有有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。无机载体。氧化铅、藻土、白土、高岭土、多孔玻璃和二氧化钛等。这种方法操作简单，反应条件温和，载体可反复使用，但结合不牢固，酶易脱落。离子交换吸附法是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。常用的载体有阴离子交换剂。如二乙基氨基乙基-纤维素、混合胺类-纤维素、乙氨基乙基(TEAE)纤维素、DEAE葡聚糖凝胶、Amberlite IRA93、410、900等。阳离子交换剂基。如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。离子交换吸附的酶吸附较牢，在工业上颇有广泛的用途。吸附法的不足之处在于酶量的选择全凭经验，pH值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和载体之间结合力不强而导致催化活性的丧失和玷污反应产物等。因此其应用受到限制，一般的科研人员都将此法于其他方法联用。2、包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称包埋法。包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化法。凝胶包埋法是将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶的脱落情况。常用的凝胶有天然凝胶如琼脂凝胶和合成凝胶如聚丙烯酰胺凝胶等。天然凝胶条件温和。操作简便，对酶活性影响甚小，但强度较差；合成凝胶强度高，对问题、pH变化的耐受性强，但需要一定的条件下进行聚合反应，且此过程中酶往往部分变性。微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。因此，此法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化如天冬酰胺酶等。另外，此法包埋的酶量很多，在医学上具有很大的应用可能性，因此越来越受到人们的注意。3、结合法选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同又可以把结合法分为离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法是通过离子键使酶与载体结合地固定化方法。常用的载体是某些水不溶的离子交换剂，如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简单。只需在一定的pH、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的例子交换住就可以使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。此法制备的固定化酶，酶的催化效率损失较少，但离子键结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。其常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、氨基酸共聚物等。其优点是：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。目前已建立的共价键结合法有叠氮法。将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝基反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团。跌但集团可以酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应制成固定化酶。叠氮法。将含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。叠氮衍生物与酶分子中的氨基形成肽键，使酶固定化。也可以与酶分子中的烃基、巯基等反应制成固定化酶。溴化氯法。含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶等可以用溴化氯活化生成亚氨基碳酸衍生物。亚氨基碳酸基团在微碱性的条件下可与酶分子上的氨基反应制成固定化酶。烷基化法。含烃基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化生成含卤素基团的活化载体。卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、烃基等发生烷基化反应制成固定化酶。4、交联法使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶。与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶固定化。其区别在于交联法使用了交联剂。常用的交联剂有戊二醛、鞣酸啪。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。 5、热处理法热处理法是将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体的方法。热处理只适用于那些稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热问题和时间，以免引起酶的变性失活。热处理法也可以与交联法或其他固定化联合使用，进行双重固定化。6、其他方法1(1)物理方法。将酶限制在半透膜或超滤膜中，使酶仍以天然状态(可溶的)长期连续使用。用此方法固定的酶有蔗糖酶、酰胺酶等。(2)利用可溶性一不溶性载体。1989年，Masayuki等报道了肠溶衣聚合物(Enteric coating polmer )Eudragit L，当pH5.0时，呈可溶性(有利于酶接近不容性底物)。三、固定化酶的特性将酶固定化制成固定化酶后，受到载体的影响，酶的特性发生了很大的变化。主要体现在：1.稳定性 固定化酶一般具有较好的耐热、耐酸碱、对蛋白酶抵抗增强、耐变性剂等稳定性2.最适温度 固定化酶比原来的游离酶的最适催化温度有或高或低的变化，在工业应用中具有很大的应用价值3.最适pH据报道，最适pH的变化是由载体的静电荷决定的，用聚合阳离子作载体，其最适pH比固定化前向酸性一侧偏移1个pH单位。这可解释为：当酶被结合到聚合阳离子载体上时，酶蛋白的阳离子数增多，从而造成固定化酶反应区域pH值比外部溶液偏碱。这样，实际上酶的反应是在反应液的pH偏碱的一侧进行的，从而使最适pH值转移到了酸性一侧，若用聚合阴离子作载体，则与上述情况相反，最适pH值移向碱性一侧。24.底物特异性 由于载体的空间位阻导致底物特异性的变化。酶固定在载体上以后，大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子质量较小的底物受空间位阻影响较小或不受影响，与游离酶的作用无显著差别。四、固定化酶的应用相比游离酶，固定化酶具有一系列其不能比的特性，固定化酶已经广泛应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等各个领域。1. 固定化酶在食品工业中的应用31.1固定化酶在乳制品生产中的应用牛奶中含有一定量的乳糖,有些人体内缺乏乳糖酶,在饮用牛奶后常出现腹泻、腹胀等症状;另外,由于乳糖难溶于水,常在炼乳、冰淇淋中呈沙样结晶析出,影响风味。乳糖酶可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,如将牛奶用乳糖酶处理则可解决上述问题。Fernandes等研究用琼脂糖作载体,固定来源于南极的冷适应菌Pseudoalterom onas sp的- 半乳糖苷酶,并应用于牛奶中乳糖的降解,生产低乳糖牛奶;Caterina等运用固定化技术,研究牛奶中碱性磷酸酶的耐热性;Mona等研究用离子吸附法固定来源于B acillus licheniform is 5A1的牛奶凝结酶,并用于干酪生产。1.2固定化酶在茶饮料生产中的应用将固定化酶法应用于茶饮料生产中,可去除异味,提高适口性,提高营养价值。李平等研究从黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液中提取-葡萄糖苷酶酶液,用丝素蛋白将其固定,此固定化酶可应用于茶汁的风味改良; 苏二正等以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋-交联的方法共固定化了单宁酶和-葡萄糖苷酶,可应用于茶饮料的除浑和增香处理。1.3 固定化酶在果汁生产中的应用在果汁生产中,榨汁前需在碾碎的果浆中加入脱果胶酶,压榨后的果汁中还要加入复合酶来进行澄清,如果用固定化酶来处理,将会大大节约成本,并减少工序。Silvia等将固定化果胶酶用于果汁澄清; Piera等研究用琼脂糖、铜离子鳌合固定漆酶,并用于苹果汁中苯酚的去除;李平等研究用丝素蛋白固定-葡萄糖苷酶,可应用于果汁食品的风味改良。造成柑桔类加工产品出现苦味的物质主要有二类:一类是如柠檬苦素、诺米林等的三萜系化合物;另一类是如柚皮苷、新橙皮苷等的黄烷酮糖苷类化合物。常采用固定化柚皮苷酶来减少柑桔类果汁中的柚皮苷含量, Puri等使用海藻糖制成载体固定化柚皮苷酶; Soare 将柚皮苷酶固定在醋酸纤维上,用此固定化酶处理后的柑橘果汁苦味明显降低。1.4固定化酶在啤酒生产中应用在啤酒生产中,需添加外源性的淀粉酶来补充天然酶的不足。此外,长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而变得混浊,为防止出现混浊,目前主要采用添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽。温燕梅等以化学共沉淀法制得的磁性聚乙二醇胶体粒子为载体,固定胰蛋白酶,该磁性酶对啤酒澄清、防止冷浑浊有明显效果; Stepanova等研究用DEAE-纤维素固定-葡萄糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶,用于樱桃、李子的果酒生产。1.5固定化酶在食品添加剂和调味剂生产中的应用低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖是三种常见的功能性低聚糖,作为保健食品受到了越来越多的重视。Jang等研究用羟磷灰石通过离子吸附法固定来源于Zym om onas m obilis的果聚糖蔗糖酶,用于制备低聚果糖; L im等研究用壳聚糖珠固定来源于A rthrobacter ureafaciens的果聚糖果糖转移酶,用于制备低聚果糖苷。陈少欣等利用海藻酸钙、明胶和壳聚糖为固定化载体, 包埋嗜热脂肪芽孢杆菌( B acillus stearotherm ophilus) 细胞合成低聚半乳糖; 毛跟年等研究了戊二醛交联、海藻酸钙包埋固定米曲霉(Aspergillus oryzae)-半乳糖苷酶的方法以及固定化酶的性质,并应用于制备低聚半乳糖。Hayashi等研究用藻酸胶和DEAE纤维素固定来源Aureobasidium 的葡萄糖基转移酶,以麦芽糖为底物制备异麦芽糖和潘糖;吴定等将壳聚糖制成中空球形,经戊二醛活化后,分别与-葡萄糖转苷酶、-淀粉酶、-淀粉酶、切枝普鲁兰酶反应制备固定化酶,四种不同的固定化酶重组构成酶催化反应器,生产低聚异麦芽糖含量达3819%。采用固定化酶法可生产天门冬氨酸和L - 苹果酸,L-天门冬氨酸可以进一步生产二肽甜味剂阿斯巴甜( aspartame) ,广泛用于水果饮料和软饮料的生产中。Nakanishi等研究固定化嗜热菌蛋白酶,以N-苯甲氧羰基L-天门冬氨酸和L -苯基丙氨酸甲基酯为底物,合成阿斯巴甜的前体物N - 苯甲氧羰基L-天门冬氨酰L-苯基丙氨酸甲基酯,再进一步合成阿斯巴甜;周华等报道了以甲壳素作为载体,固定大肠杆菌( Escherichia1coli)细胞制备L -天冬氨酸的最佳固定化条件;王普等报道以改性PVA为载体,固定化细菌ZG- 4株生产L-苹果酸的研究。酪蛋白磷酸肽在小肠中能促进钙吸收,又被称为促钙吸收因子,广泛用于功能食品及营养保健食品中。Lorenzen等研究固定化胰蛋白酶,以酪蛋白为底物制备酪蛋白磷酸肽;谷坤睿等以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂进行胰蛋白酶的固定化研究,以此来制备酪蛋白磷酸肽。固定化葡萄糖异构酶早己应用于工业化生产,可用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖浆。Converti 等研究固定化来源S treptom ycesm urinus的葡萄糖异构酶,用于连续生产玉米高果糖浆; Illanes等研究固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶反应器,用于以乳清为底物连续生产高果糖浆。1.6固定化酶在油脂改性中的应用脂酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应,在油脂工业中被广泛应用。Meron等研究用尼龙和纤维素酯固定来源Candida cy lindracea的脂酶,对一种巴西棕搁油进行酶解改性制备代可可脂; Rao等研究用固定化Rhizom ucor m iehei 的脂酶L ipozyme IM60催化酸解鳕鱼肝油,制备富含- 3或- 6多不饱和脂肪酸的结构脂;赵海珍等从五种脂酶中筛选出来自T1languginosa 的固定化脂肪酶L iopzyme TL IM,此固定化酶催化改造猪油制备功能性脂的效果最好。1.7固定化酶在食品分析与检测中的应用传感器是一种能将被测量的信号转换成为可输出信号的装置,固定化酶生物传感器是将固定化酶作配基组装的生物传感器, 可用于食品分析与检测。 Adanyi等研究了三组固定化酶多酶生物传感器,可用于乳制品中乳糖以及添加的葡萄糖、淀粉等的检测; Anjan等研究共固定化L -谷氨酸盐氧化酶和L-谷氨酸盐脱氢酶生物传感器,用于食品中L-谷氨酸单钠的检测;Meera研究流动注射分析系统固定化柠檬酸裂解酶和草酰乙酸脱羧酶生物传感器,用于检测果汁中的柠檬酸盐含量; Michael等研究用溶胶固定乙酰胆碱酶和细胞色素P450BM- 3突变株,制备双酶传感器,用于食品中磷硫盐杀虫剂的检测。2. 固定化酶在化学及化工领域中的应用研究4水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的酶促合成,如硅藻土固定化木瓜蛋白酶可在乙酸乙酯介质中催化合成Leu - 脑啡肽前体Boc - Phe -Leu - OMe 、产率高达90 %以上;固定化嗜热菌蛋白酶可高产率及专一性催化合成高甜度低热量的二肽甜味剂Aspartame 的前体Z - L - Asp - L - Phe -OMe 、并可同时实现天冬甜精的生物合成与DL -苯丙氨酸甲酯的光学拆分。通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备、且具有潜在的应用前景。脂肪酶既能催化天然油脂及酯类的水解,也能在有机介质中催化酯的合成、交换、氨解及肽合成而具有重要工业价值, 故固定化脂肪酶的研究颇受重视。固定化酶在化学及化工领域中的应用研究也是人们感兴趣的课题,通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备,且具有潜在的应用前景。3. 在环境科学中的应用5-8随环境污染的日趋严重及其治理的日益迫切,固定化酶在环境科学领域将具有重要用途,固定化胆碱酯酶对有机磷化合物具有较高的检测灵敏度,可用于环