His-Tag蛋白纯化步骤.doc

变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用1 PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1 PBS），并按上述方法进行超声破菌。2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。若有必要，用1 PBS洗包涵体几次。3、用Binding/Wash Buffer（约每毫升沉淀加5ml 1 PBS）溶解包涵体，并在室温下孵育3060分钟。若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。4、12000rpm离心30min，取上清至一干净管中。His标签蛋白的重力纯化流程1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。1、平衡柱子的工作温度。应在室温或4下进行纯化。2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。3、用2倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，以0.51 ml/min的流速过柱。4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。直到流出液的吸光度在280 nm基线处。6、用两倍树脂体积的Elution Buffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit（No SK3041）。洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M尿素的缓冲液透析。就地清洗方案如果背压增加或观察到树脂明显污染，通常进行完全性能恢复流程。由于所有的NI-IDA树脂的高螯合强度和低金属浸出率，就地清洗前不需要进行stripping。我们建议使用下面的方法，以清除污染物，如沉淀的蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白。程序1、用15倍树脂体积的0.5 M NaOH清洗柱子。考虑到需要30min的接触时间，因此需相应地调整流量（如用0.5 M NaOH溶液以0.5ml/min的流速洗1ml的NI-IDA柱，需要相当于15ml总体积的量）。2、用10倍树脂体积的1 PBS重新平衡后，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入2030%乙醇或10100mM氢氧化钠进行4保存。通过洗脱（stripping）和离子重填装进行再生NI-IDA柱的洗脱（stripping）和再填装通常是没有必要的。如果背压增加或观察到树脂明显污染，就地清洗过程通常可恢复性能。但若性能仍不令人满意，柱子内的NI-IDA树脂可用下面的程序进行洗脱（stripping）和离子重填装。程序1、用10倍树脂体积的洗脱缓冲液（Stripping Buffer）（50 mM磷酸钠；300 mM NaCl；100 mM EDTA，pH值8.0）洗涤树脂。2、用20倍树脂体积的去离子水清洗树脂。3、用2倍树脂体积的100mM NiSO4（用去离子水配制）进行离子再填装。4、10倍树脂体积的去离子水清洗，并用10倍树脂体积的1 PBS重新平衡树脂，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入2030%乙醇或10100mM氢氧化钠进行4保存。问题解答问题可能的原因建议流速太慢样品太黏l 如果纯化是在4进行，那改为在室温下进行。l 超声破菌前或超声破菌后增加细胞裂解物的稀释度。l 继续超声破菌，直到黏度下降；和/或额外加入DNAse和Mg2+。l 如果用很黏稠的溶液，将柱子连接到真空管以增加流速纯化过程中目的蛋白难溶或沉淀l 添加去垢剂或其他物质，缓慢混合30min以增加目的蛋白的可溶性。注意：Triton X-100和NP-40（不是Tween）在280nm具有高吸光度，此外，去垢剂不能通过缓冲液置换而轻易去除。l 包涵体：用常规变性剂如46 M盐酸胍、48 M尿素或强变性剂，蛋白很容易从包涵体中溶解（和去折叠）。缓慢混合30min或更长时间以助溶目的蛋白。His-Tag蛋白产量低His-Tag蛋白没有完全被洗脱l 额外增加几毫升的elution buffer进行洗脱样品制备和洗涤过程中发现流出液中存在His-Tag蛋白l 样品和结合缓冲液中咪唑浓度太高，使用低浓度的咪唑。l 确定样品中螯合剂或强还原剂的浓度不要太高。l 组氨酸标签可能暴露不充分；对包涵体，可用尿素或盐酸胍对去折叠的蛋白进行纯化。减少样品的稀释，增加固体尿素或盐酸胍。l 组氨酸标签丢失。检查结构的序列。纯化过程中His-Tag蛋白没有被洗脱下来l His-Tag蛋白仍然被结合。洗脱液中用高浓度的的咪唑进行洗脱l 目的蛋白沉淀在柱子中，减少样品的量；l 洗脱过程中降低咪唑的量。尝试去垢剂或改变NaCl的浓度或在变性（去折叠）条件下洗脱。非特异性疏水或其它互作。l 在洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂或增加NaCl的浓度。洗脱的His-Tag蛋白不纯样品和缓冲液中咪唑的浓度太低l 样品和缓冲液中使用高浓度的咪唑以阻止杂蛋白结合。推荐使用2040mM，但更高浓度可能也适合。未结合物质洗涤不充分样品制备后重复洗涤步骤以获得最佳纯度His-Tag蛋白被蛋白酶部分降