酵母菌选育、最适培养基筛选及菌种发酵培养.doc

河北师范大学生命科学学院08级生物技术专业 酵母菌选育、最适培养基筛选及菌种发酵培养摘要 在无菌条件下，用紫外线对酵母菌(yeast)进行不同时长的照射诱变处理，选出合适的诱变菌种进行振荡培养。经振荡培养后的诱变菌种运用正交试验设计的方法采用四个因素三个水平选出最适的菌种培养基，进行进一步的发酵培养。在发酵罐中加入最适培养基成分和合适的酵母菌诱变菌种进行发酵扩培，最终获得大量的菌种和发酵产物。关键词 酵母菌，紫外线，最适培养基，正交试验设计，发酵培养 - 9 - 面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种单细胞微生物，是酵母菌的一种,它含蛋白质50左右，氨基酸含量高，富含B族维生素，还有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质。几千年前人类就用面包酵母发酵面包和酒类，在现代食品工业方面，广泛用作人类主食面包、馒头、包子、饼干糕点等食品的优良发酵剂和营养剂。本实验选用的物理诱变因子为紫外线，DNA能强烈吸收紫外线，尤其是碱基中的胸腺嘧啶，从而在形成二聚体，改变DNA结构，引起基因突变。本实验的面包酵母菌经不同时长的紫外线诱变处理，培养出的适合的诱变菌种进行最适的菌种培养基的筛选和发酵培养。最适菌种培养基的筛选是通过正交实验设计进行的。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。正交表是一整套规则的设计表格，用 L为正交表的代号，n为试验的次数，t为水平数，c为列数，也就是可能安排最多的因素个数，本实验采用了四因素三水平进行最适培养基的筛选。选出合适的诱变菌种和适合诱变的酵母菌生长的培养基后，便可以能过发酵罐进行发酵培养，分时段观察记录发酵过程中的PH，溶氧，菌种数。绘制出面包酵母的生长曲线材料与方法1.1 实验材料菌种：面包酵母菌仪器：高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，光学显微镜，恒温培养摇床，分析天平，小型发酵罐用品：枪头及1mL和0.5mL移液器，三角瓶，试管，玻璃涂棒，平皿，血球计数板，酒精灯，棉塞，试管架，盖玻片，记号笔试剂：酵母膏，蛋白胨，(NH4)SO4，葡萄糖PDA培养基，PDA液体培养基（不加琼脂）：去皮马铃薯 200克、 葡萄糖 20克、琼脂 20克、自来水1000毫升、 自然PH其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加1020g葡萄糖和1720g琼脂，高压蒸气（121）灭菌20分钟，冷却后贮存备用。1.2 试验方法1.2.1酵母菌选育1) 制备PDA固体培养基和液体培养基（不加琼脂），将所用用具如玻璃涂棒，9mL无菌水试管，培养皿，斜面试管等包好，121，30min 高压蒸汽灭菌。2) 在超净工作台中，制备固体培养基平板和液体培养基试管，用移液器取1mL菌悬液加入9mL无菌水试管，依次进行浓度梯度稀释，取稀释菌液进行计数，选取合适浓度梯度，进行涂板。3) 由于固体培养基制备的量不足，实验选取2个浓度梯度，紫外线照射时长选定为50s,70s,90s，进行涂布，涂布平板情况如下（表1），涂布后，紫外灯下照射诱变。表1 涂布平板个数 浓度梯度 0s 50s 70s 90s 1x107 1 2 2 21x108 1 2 2 24) 诱变后在30培养2天后，进行平板计数，计算死亡率，挑取诱变单菌落于PDA液体培养基中30振荡培养。1.2.2最适培养基筛选 1) 酵母菌发酵配方：酵母膏 10g，蛋白胨 10g，（NH4）2SO4 5g，葡萄糖 20g，PH 6.4，选取酵母膏，蛋白胨，（NH4）2SO4，葡萄糖四个因素配成培养基母液，按四因素三水平的正交表（表4）和实验因素与水平表（表2）配制液体培养基，后进行高压蒸汽灭菌。表2 实验因素与水平水平因素酵母膏蛋白胨(NH4)2SO4葡萄糖10.50.5 0.25 12 1 10.523 2 2142) 将酵母菌菌液加于液体培养基中，28振荡培养2天，用活体计数法计算试管内菌体密度，进行级差分析。1.2.3菌种发酵培养1) 按照设备流程图认识发酵罐，了解发酵培养的流程。2) 校正pH计（46.68）根据正交试验设计结果配制最适培养基，将配好的发酵培养基12L（酵母膏180g、蛋白胨 60g、(NH4)2SO4 60g、葡萄糖 240g）倒入发酵罐中,进行分批灭菌(开启401,关闭404与302开启搅拌,开启202关小403使温度上去至11810分钟灭菌之后，开启401关小402开启203与A9将接种盖开松。关闭405与203，打开402降压，关闭401打开102、 101之后调节402),然后将菌种使用火焰保护法迅速接种到发酵罐中。3) 发酵过程中，每隔30分钟观察记录pH和DO值的变化，每隔1小时取样进行活体计数。4) 根据pH、DO、菌数的变化绘制标准曲线。5) 发酵培养结束后，进行倒罐，对发酵罐进行清洗。2 结果与分析2.1 酵母菌选育经活体计数的菌体密度为3.55x109，选取10-7、10-8浓度梯度进行涂布，紫外线照射时长为50s、70s、90s。诱变处理后培养得：在未经照射的空白对照平板上长出的菌落极少，紫外线诱变处理后的平板上没有长出菌落。由于在计数时稀释浓度记错，菌体实际浓度应为3.55x108，因按菌体密度为3.55x109，选取10-7、10-8浓度梯度进行涂布，故实际涂平板的菌体较少。又因为固体培养基制备的量不足，选取的浓度梯度由最优的三个变为两个，再经紫外线照射时选取的时间较长，不利于原本较少的菌体诱变生长，故诱变的平板上没有长出菌落。表3 涂布诱变和诱变涂布的死亡率比较死亡率诱变时长60s75s涂布诱变70%90.7%诱变涂布42.17%76.09%在进行酵母菌选育时，我们选用了涂布诱变的方法，这种方法均匀度好，但由于平板涂布的菌体较菌悬液来说较少，所以诱变的突变率较低。而采用诱变涂布的方法，菌悬液的浓度高，突变率大，但诱变后涂板培养的工作量较涂布诱变来说大很多。由表3的数据可观察得出：先诱变再涂布的方法菌种的死亡率远低于先涂布再诱变的死亡率（此为一次实验结果可能会产生微小误差）。故实验室中一般采用诱变涂布的方法来增加菌种的突变率，获得所需的突变菌株。2.2 最适培养基筛选表4 正交试验结果NO.因素酵母膏蛋白胨(NH4)2SO4葡萄糖实验结果111111.30108212221.61108313332.2710842123280108623121.85108731322.20108832132.35108933211.15108K11.731.881.831.08K21.6O1.591.841.89K31.901.761.762.25R0.300.290.081.17从表4的数据R可以得出影响因子主次依次为葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、 (NH4)2SO4。其中葡萄糖为菌体生长的主要影响因素，酵母膏蛋白胨的影响作用相近，(NH4)2SO4次要影响因素。最优的培养基配方为第八组的培养基配方，即2%酵母膏、1%蛋白胨、0.25% (NH4)2SO4、4%葡萄糖。在实际实验操作中，小范围的PH值变动对菌体生长影响不大，因此在选取影响因子时，PH较葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，(NH4)2SO4的影响小些。从正交试验的极差分析（图1）中可看出，葡萄糖的影响作用随浓度增大而增大。酵母膏，蛋白胨，(NH4)2SO4的影响曲线变化不规则，此为一次实验的结果，可能会产生误差。再由R值分析可得四个因素的影响作用大小依次为葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、 (NH4)2SO4。2.3菌种发酵培养表5 发酵培养中的条件变化时间（h）菌数（106）pHDO01.355.38100.00.55.3590.01.02.105.3282.71.55.3178.52.07.855.2872.62.55.2575.33.014.355.2168.63.55.1762.14.021.505.1034.24.55.0476.65.041.54.9563.55.562.54.8654.4随着发酵培养的进行可从表5观察出发酵培养基的pH、DO值逐渐下降，菌体的数量逐渐增加，发酵进行到4.5小时时由于发酵罐的压力突然掉零，使溶氧值迅速下降，经调整通气管路，使压力回升，发酵液中的溶氧量回升，后随发酵进行DO值开始逐渐下降。在发酵的过程中还应进行还原糖的测定（DNS比色法）和氨基酸浓度的测定（甲醛滴定法），对发酵过程的参数变化进一步完善。由面包酵母的生长曲线（图2）可以看出面包酵母在发酵过程中菌数一直呈现上升状态，其生长速率也在增加。在01h之间菌数变化较小，此时面包酵母处在新的培养环境的适应阶段；在14h之间，菌数有一定幅度的上升，酵母的生长速率提高，说明面包酵母适应了新的培养环境，开始大量分裂繁殖；在45.5h之间，曲线的增幅明显增大，酵母的生长速率明显增快，说明菌体进入旺盛生长期。在发酵培养的过程中酵母的生长要经历延迟期、对数期、稳定期、衰亡期四个阶段，由于实验时间的限制，这四个时期的有生长曲线观察得只进行到了延迟期和对数生长期的起始部分，从这部分的发酵培养中，可观察得出：菌体从开始适应新的养环境，生长缓慢，到适应环境，生长显著增加的过程中，菌体的生长速率一直呈现增长状态，说明菌体的活性也在不断地增加。根据面包酵母发酵pH变化曲线图（图3），可以观察出发酵液随发酵培养时间的延长pH值一直呈现逐渐下降状态，pH的变化由开始的5.38变为最终的4.86，变化范围达0.52，且下降的趋势也逐渐增大。这是由于面包酵母在发酵过程中分解发酵液中营养物质，自身释放酸性物质，使发酵液中H+不断积累，发酵液pH不断下降。随发酵的进行，菌数不断增加，菌体分裂旺盛，发酵液的pH值下降的愈发明显。根据面包酵母发酵过程中溶氧变化曲线（图4），可以看出发酵液的DO值随时间大体呈下降趋势。在03.5h之间，溶氧量的大体呈逐渐下降的趋势；发酵到3.5h时发酵罐发生漏气，罐内的压力迅速掉0，罐内压力突然下降，发酵液中溶氧迅速释放，发酵罐内溶氧量急剧下降；经调整通气管路处理后，压力回升，发酵液中的溶氧量回升。44.5h溶氧量回升，4.5h后溶氧量基本稳定且继续随着发酵时间的延长而下降。， 根据面包酵母的菌体生长曲线（图2）、面包酵母发酵pH变化曲线图（图3）、面包酵母发酵过程中溶氧变化曲线（图4）可知：随着面包酵母的生长，发酵液中的营养物质和溶氧被菌体消耗，导致发酵液中pH和溶氧量呈现下降状态，且随着面包酵母菌生长速度的加快，菌体消耗营养物质和溶氧的速度也加快，导致发酵液的pH值和溶氧量下降速度也相应增加。3 实验改进3.1酵母菌选育 酵母菌选育的注意事项：1) 由于选用的面包酵母菌种的个体较大，易沉淀，因此在进行酵母菌浓度梯度稀释、计数和涂布时应将菌悬液摇匀，再进行后续步骤。2) 酵母菌摇培应采用斜培的方法，好氧菌正培只会在液体培养基的表面形成菌膜，不利于菌的生长。3) 对照取小梯度，诱变取大梯度，经换算求统一。4) 诱变一般应取三个梯度进行比较，避免在实验中可能出现的平皿上菌的生长量过多或过少的情况。5) 为了获得更高的突变率，诱变应选取先诱变再涂布的方法。 酵母菌诱变的方法改进：酵母菌种的诱变育种多采取传统的紫外诱变和化学诱变等方法，但此类方法对同一菌株反复处理后，由于其作用方式及作用位点的相对单一性，会出现钝化现象，导致突变类型少，诱变效果不佳。而微波诱变【2】作为一种新型的诱变方法，所需设备简单，方法易行，操作安全，且诱变效果较好，克服了紫外诱变容易光修复及化学诱变毒性大等缺点，而且该方法较之基因工程育种成本更低，在工业微生物菌种育种中具有较大的推广价值和广阔的应用前景。微波诱变：取培养至对数生长期的合适浓度的菌悬液5 mL于无菌培养皿中，采用脉冲频率为2450 MHz，功率为800 W的微波炉（MG823ESJ-SA微波炉）悬液分别处理5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s、40 s、50 s和60 s，然后各取菌悬液0.1 mL均匀涂布于YEPD平板，置于28培养2 d，以平板菌落记数法进行活菌记数，绘制微波致死曲线。3.2 最适培养基筛选最适培养基筛选的注意事项：1) 在选取影响因素后，可溶的因素配制母液再进行稀释后，获得所需的水平。不溶的因素单个加。2) 进行计数时，菌悬液从计数板的一侧倾斜加入，计数时上下两个区域计数求平均。3.3菌种发酵培养菌种发酵培养的注意事项：1) 在进行发酵之前要检查整个发酵设备是否已经准备妥当，可以确保发酵正常进行。2) 在取样时要严格执行取样阀的操作步骤，防止因取样而引起污染。3) 在发酵过程中注意pH值的调控，保证整个发酵过程中pH能维持在最佳状态。4) 因为在灭菌时会产生水分进入培养基，因此培养基加入量应少于12L。5) 灭菌后的培养基放于37的培养箱中培养，观察灭菌是否彻底，经24h培养无菌生长，则灭菌彻底。4 结论菌种选育中面包酵母经过紫外线诱变处理后得到了合适的突变菌株；在最适培养基筛选过程中选取葡萄糖、酵母膏、(NH4)2S