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在牛奶中培养瑞士乳杆菌发酵混合酸和生产多糖关键词：乳杆菌，牛奶发酵，多糖摘要：瑞士乳杆菌在牛奶中生长pH值控制在6.2与培养物没有pH值控制（ = 0.5 h - 1， 380 mg多糖L - 1，210 mM乳酸）相比有一个缓慢增长的速度（ = 0.27 h - 1）生产较少的胞外多糖（49mg L - 1） ，但乳酸产量增加（425 mM）。两种不同的培养条件都表现出混合酸发酵生成醋酸，这一发酵过程不仅关系到柠檬酸代谢，而且还与丙酮酸途径有关。引言瑞士乳杆菌，一种专属同型发酵乳酸菌（LAB） ，在乳制品加工行业作为发酵剂培养物在制造酸奶，硬奶酪和意大利干奶酪发面发挥了重要作用。胞外多糖（EPS）产生菌合并作为发酵剂菌种将避免使用在大多数欧盟国家不允许的植物或动物来源的添加剂（吉布森和罗伯1995年），其带来提高了流变性能的新产品的开发，。在牛奶中用柠檬酸代谢生产醋酸和/或双乙酰与许多发酵乳制品风味的研发同样重要。但是很少有报告涉及嗜热乳酸杆菌柠檬酸代谢（希基等，1983年）。 本文讨论了瑞士乳酸菌在牛奶中用自然条件发酵和pH控制发酵两种方式生产胞外多糖及发酵模式。材料与方法 微生物的生长条件 瑞士乳杆菌ATCC 15807接种在灭菌（115，20分钟）的10 （w/ v）的再生脱脂乳，在工作容积2000毫升的发酵罐中，37，培养60小时。在无通风条件下，自然pH和控制pH（用无菌的1mol NH4OH调整pH至 6.2）两种方式同时分批发酵培养。温度(37)，搅拌速率（转速 100min1）和pH值自动化控制。 发酵过程允许进行60h; 样品在不同的时间间隔从发酵容器中被无菌地回收，并立即放在冰上冷却以确定胞外多糖的收益率，细胞活力， 最终产物，柠檬酸消耗量，剩余的乳糖和其水解产物（葡萄糖和半乳糖）。 特定生长率（max）是通过计算一个半对数图像c.f.u.mL-1时间的斜率得到。细胞活性测定是通过适当地稀释后在MRS琼脂平板中培养后测定（De Man et al.1960年）。平板上菌落经37，48 h培养逐渐形成，结果表示为c.f.u.mL- 1 。 图1 由瑞士乳杆菌在牛奶分批培养的细胞存活率()和EPS的产量(-); （a）pH值6.2 ，（b）自然pH值。 胞外多糖的量化和单体分析 从分离的EPS中取出 100 毫升用E型XIV链霉蛋白酶（）水解牛奶蛋白质所得的样品。EPS通过离心分离，用乙醇沉淀（ Mozzi等.1996年），在2 mL 蒸馏水中冷冻干燥，并用琼脂糖凝胶柱4B （）测定其分子质量（MW）。用0.05M Tris/HCl缓冲液（pH 7）洗脱抽提得到 EPS ，并用混合的葡聚糖（）以每个 0.25 mg ml1校准凝胶柱(分子量 39 100; 73 000;515 000 和 2 000 000)。绘制葡聚糖的相对分子质量的对数洗脱体积的图像确定EPS的相对分子质量。经纯化和水解（3M三氟乙酸，在100处理6小时）EPS后得到的单糖组成是用高效液相色谱法测定，用有机酸色谱柱（ Phenomenex ）在55以水为流动相， 速度0.6 ml min1 。计算相对比例的峰面积以估计单体组成。总EPS量（表示为mgL- 1的）以葡萄糖作为标准使用苯酚硫酸法（Dubois等人.1956年）估计。其他测定残留的乳糖，葡萄糖和半乳糖以及乳酸和醋酸分别用如上所描述的高效液相色谱法测定;柠檬酸测定使用酶学方法（Boehringer Mannheim GmbH, Germany）。在高效液相色谱分析前，样品用Carrez方法（Boehringer）净化 。结果用mM表示。 重复性 本文提出的所有结果是三个实验的平均值。结果之间的差异小于10 。 结果和讨论 瑞士乳酸杆菌ATCC 15807在牛奶中分批培养的生长动力学和乳酸及EPS 产量由与非pH控制的培养是完全不同的（图1-3）。在pH值为6.2（图 1a ），培养物显示出一个低的特定生长率（ = 0.27 h- 1），细胞活力（3 108个细胞集落ml-1）和EPS的形成物（49mg/ L） ，但高乳酸产量（425 mM） （图2a ）;这一事实表明，糖代谢主要是用于合成乳酸而不是EPS。在pH 6.2时在培养基中积累的乳酸，对于尽快开始稳定期和低细胞存活率似乎是关键因子（图1a ）。相比之下，培养在非pH值控制的条件下以更高的增长率生长（ = 0.5 h- 1） ，生产83 以上的EPS（360 mg/L）（图1b） ，但少于49 的乳酸（210mM）（图2b）。 分离的EPS是高分子聚合物（ 8.2 105 至2 106 ） ，其中含有大量的磷酸盐（平均水平81%），葡萄糖和乳糖比例为1:1 （ pH6.2 ）和2:1 （自然pH） ，和微量的鼠李糖（总糖含量的6.1%）。在它们的化学组成中EPS没有差异。尽管如此，在pH值6.2培养物是不成粘丝的可能是由于乳酸的产量和/或水解酶的存在（ Cerning等. 1988年）。 在自然pH值条件培养，发酵24小时后乳糖浓度几乎是零，pH6.2，大约剩余40mM糖（图3a和3b ）。瑞士乳杆菌ATCC 15807释放葡萄糖和半乳糖到生长的牛奶中，微生物生长状况依赖于培养时间和培养条件。 在pH值为6.2（图3a ），微生物完全地消耗两种处于较高浓度（42-46mM）的糖，在自然pH值条件下培养发酵60 h后（图2b）。乳糖枯竭后稳步形成乳酸的pH值（图 2b）可能与葡萄糖和半乳糖的消耗有关。 瑞士乳杆菌ATCC 15807在自然pH和控制pH的条件下发酵显示混合酸发酵与作为最终产品的乳酸（210-245mM）和醋酸，这是与在指数阶段的柠檬酸代谢有关（最多12小时） （图2a和2b ）。在无pH控制的条件下培养柠檬酸目前在牛奶中几乎完全代谢，当pH值为6.2时大约剩余4.6mM。在发酵60h后，醋酸总量在自然条件（13.4mM） ，控制pH值（ 16.5mM），清楚地表明这是通过替代途径从丙酮酸合成。以下是理解，柠檬酸由柠檬酸酶裂解生产醋酸（不含三磷酸腺苷的形成）和等分子浓度的草酰乙酸盐。该草酰乙酸脱去羧基变成丙酮酸，这反过来将被分成醋酸-通过丙酮酸脱氢酶和醋酸激酶途径-导致三磷酸腺苷的产生(Marty-Teysset 等.1996年，Garrigues等. 1997年）。该脱羧基的草酰乙酸在酸性环境中将发挥作用。根据toMagni等。（1999年），吸收的柠檬酸，耦合糖酵解中产生乳酸的流出过程，是一种调节机制维护pH值平衡，通过草酰乙酸脱羧消耗质子。此外，产生的醋酸是比乳酸更抗菌的化合物，可以帮助同型发酵的乳酸细菌在自然