CN104719611A通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法

CN104719611A通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号xx10697710.X (22)申请日xx.12.18A23J3/34(xx.01)A23J3/16(xx.01) (71)申请人中粮营养健康研究院有限公司地址100020北京市朝阳区朝阳门南大街8号申请人中粮集团有限公司 (72)发明人刘新旗张连慧王一刘泽龙贺寅应欣郑岩涂丛慧杨佳王宇 (74)专利代理机构北京信慧永光知识产权代理有限责任公司11290代理人张淑珍洪俊梅 (54)发明名称通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法 (57)摘要本发明涉及通过酶解大豆蛋白来制备大豆肽的方法。 该方法所得大豆肽苦涩味低，大豆肽得率高，其中的游离氨基酸及分子量小于150Da或分子量大于2000Da的肽段含量均较低。 所述方法包括如下步骤将大豆分离蛋白加水配制成4wt%-12wt%的大豆分离蛋白液，调节温度和pH，然后将适量的作为内肽酶使用的碱性蛋白酶和中性蛋白酶以及作为外肽酶使用的风味蛋白酶按照先加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶、后加入风味蛋白酶的顺序加入，进行酶解反应，调节酶解液的pH，灭酶，离心取上清液，进行杀菌后，喷雾干燥得到大豆肽。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书8页 (10)申请公布号104719611A (43)申请公布日xx.06.24104719611A1/1页21.一种通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法，所述方法包括如下步骤 （1）将大豆分离蛋白加水配制成4wt%-12wt%、优选6wt%-10wt%的大豆分离蛋白液，制备大豆分离蛋白液； （2）向步骤 （1）中制备的大豆分离蛋白液中滴加酸性调节剂或碱性调节剂，调节pH至5.0-9.0，调节温度至30-60，然后，加入作为内肽酶使用的碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解1-3h，再加入作为外肽酶使用的风味蛋白酶，酶解1-3h； （3）酶解结束后，滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节酶解液的pH至4.0-5.0，将酶灭活，1000g-5000g离心10-30min，取上清液，置于100-180、优选130-160的温度下杀菌处理30-120s、优选60-90s，之后喷雾干燥得到大豆肽。 2.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤 （2）和步骤 （3）中的碱性调节剂为NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液，优选NaOH溶液。 3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤 （2）和步骤 （3）中的酸性调节剂为磷酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液、柠檬酸溶液、乙酸溶液以及它们相对应的食品领域中常用的酸性盐，优选磷酸溶液或盐酸溶液。 4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的碱性蛋白酶为碱性丝氨酸蛋白酶、碱性天冬氨酸蛋白酶和碱性金属蛋白酶，优选Alkaline protease、Alcalase2.4L FG。 5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的中性蛋白酶为霉菌中性蛋白酶和细菌中性蛋白酶，优选Alphalase、Neutrase0.8L。 6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的风味蛋白酶为Foodpro51FP、Flavourzyme。 7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重而言，所述步骤 （2）中的碱性蛋白酶的添加量为0.5wt%-5wt%、优选0.5wt%-2wt%。 8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重而言，所述步骤 （2）中的中性蛋白酶的添加量为0.5wt%-5wt%、优选0.5wt%-2wt%。 9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重而言，所述步骤 （2）中的风味蛋白酶的添加量为0.1wt%-3wt%、优选0.2wt%-1wt%。 10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述步骤 （2）进一步包括在加入碱性蛋白酶之前或之后，向所述大豆分离蛋白液中加入含有Ca2+的溶液。 权利要求书104719611A21/8页3通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法技术领域0001本发明涉及酶解大豆蛋白的方法。 更具体而言，本发明涉及通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法。 背景技术0002大豆肽是大豆蛋白质经微生物发酵法分离、酸法分解或酶法酶解，并经过精制而得到的多肽混合物，以小分子肽（分子量150Da且2000Da）为主，还含有少量大分子肽（分子量大于2000Da）、分子量小于150Da的寡肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分，相对分子质量在5000Da以下。 大豆肽的蛋白质含量为85wt%左右（通过凯氏定氮法测定N含量计算得出），其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，必需氨基酸的组成平衡良好且含量丰富。 大豆肽具有无豆腥味、不会发生蛋白变性、酸性条件下不发生沉淀、加热时不凝固、易溶于水、流动性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。 0003目前，工业上一般采用酶解法制备大豆肽。 但是，目前的酶解法所得到的酶解产物由于疏水基团暴露会带有较强的苦涩味，而且所述酶解还会产生较多的游离氨基酸，使得到的产物中肽含量相对较低。 一般来讲，将游离氨基酸的含量控制在10wt%之内、优选在5wt%之内是适当的；并且根据大豆肽粉中国国家标准（GB/T22492-xx）的规定，一级大豆肽粉中必须含有不少于80wt%的相对分子量不高于2000Da的肽段。 因此，需要开发出将大豆肽中的肽段的相对分子量尽可能控制在150-2000Da之间的新的酶解技术。 0004日本专利JPxx-324372中公开了一种经过两步酶解以及植酸酶处理来获得大豆肽混合物的方法，所述方法包括如下步骤从豆粕提取物中得到大豆分离蛋白液，先在碱性至中性的条件下加入内肽酶酶解，灭酶后将溶液调节至酸性，再加入外肽酶和植酸酶先后进行酶解、杀菌、喷雾干燥，最后得到大豆肽粉末。 由该方法得到的终产物在冷藏状态下的酸溶液中也不会形成渣滓。 然而，该发明中并没有大豆肽的得率和感官评价的数据。 并且，该发明所述的方法总在使用外肽酶进行酶解前，需要对溶液的pH进行调整。 因此，所述方法在操作上更加复杂，不利于工业化使用。 此外，由于该方法所得大豆肽混合物的平均分子量优选200-5000Da，也反映出了该方法所得大豆肽中的各肽段大小差异较大，而无法实现使产物主要集中于合适的分子量范围内（如150Da-2000Da）。 0005中国专利申请102578367A中公开了一种利用挤压膨化预处理大豆片和超声辅助酶解所得高温豆粕来生产大豆肽的方法。 该发明优选的酶解高温豆粕制备的大豆肽酶解度为36.88%，大豆肽得率为34.56%（即，该方法中的大豆肽得率偏低）。 并且，该专利申请文献中没有感官评价及分子量分布的数据。 发明内容0006本发明采用内肽酶（例如，作为内肽酶使用的碱性蛋白酶与中性蛋白酶）、外肽酶（例如，作为外肽酶使用的风味蛋白酶）联合酶解的方法。 相对于现有技术而言，本发明的方法不仅在程序上更加简单（如，在使用外肽酶进行酶解前无需调节溶液的pH、无需植酸酶处说明书104719611A32/8页4理的过程），而且所制备得到的大豆肽苦涩味低，且得率较高。 0007在本发明的方法中，首先将大豆分离蛋白加水配制成大豆分离蛋白液，并通过pH调节剂对该蛋白液的pH值进行调节，使之适合于后续内肽酶发挥最佳酶活性。 酶的加入顺序采用先加入内肽酶、后加入外肽酶的方式，以避免外肽酶酶解时间过长而导致游离氨基酸含量过高。 酶解结束后，将pH调节到4.0-5.0，将酶灭活，促使未酶解的蛋白分子聚集沉淀，使得大豆肽产品中分子量大于2000Da的肽段含量显著降低。 0008可通过如下段落1至段落21中所述的内容对本发明的技术方案加以说明00091.一种通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法，所述方法包括如下步骤0010 （1）将大豆分离蛋白加水配制成4wt%-12wt%、优选6wt%-10wt%的大豆分离蛋白液，制备大豆分离蛋白液；0011 （2）向步骤 （1）中制备的大豆分离蛋白液中滴加酸性调节剂或碱性调节剂，调节pH至5.0-9.0，调节温度至30-60，然后，加入作为内肽酶使用的碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解1-3h，再加入作为外肽酶使用的风味蛋白酶，酶解1-3h；0012 （3）酶解结束后，滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节酶解液的pH至4.0-5.0，将酶灭活，1000g-5000g离心10-30min，取上清液，置于100-180、优选130-160的温度下杀菌处理30-120s、优选60-90s，之后喷雾干燥得到大豆肽。 00132.如段落1所述的方法，其中，所述步骤 （1）中的水为自来水、去离子水、双蒸水和/或超纯水，优选去离子水。 00143.如段落1或2所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的pH为7.0-8.0。 00154.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的温度为45-55。 00165.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）和步骤 （3）中的碱性调节剂为NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液，优选NaOH溶液。 00176.如段落1-5中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）和步骤 （3）中的酸性调节剂为磷酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液、柠檬酸溶液、乙酸溶液以及它们相对应的食品领域中常用的酸性盐，优选磷酸溶液或盐酸溶液。 00187.如段落1-6中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的碱性蛋白酶为碱性丝氨酸蛋白酶、碱性天冬氨酸蛋白酶和碱性金属蛋白酶，优选Alkaline protease、Alcalase2.4L FG。 00198.如段落1-7中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的中性蛋白酶为霉菌中性蛋白酶和细菌中性蛋白酶，优选Alphalase、Neutrase0.8L。 00209.如段落1-8中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的风味蛋白酶为Foodpro51FP、Flavourzyme。 002110.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重而言，所述步骤 （2）中的碱性蛋白酶的添加量为0.5wt%-5wt%、优选0.5wt%-2wt%。 002211.如段落1-10中任一段所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重而言，所述步骤 （2）中的中性蛋白酶的添加量为0.5wt%-5wt%、优选0.5wt%-2wt%。 002312.如段落1-11中任一段所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重而言，所述步骤 （2）中的风味蛋白酶的添加量为0.1wt%-3wt%、优选0.2wt%-1wt%。 说明书104719611A43/8页5002413.如段落1-12中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）中的酶解在水浴锅、恒温箱、烘箱或恒温加热器中进行。 002514.如段落1-13中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （2）进一步包括在加入碱性蛋白酶之前或之后，向大豆分离蛋白液中加入含有Ca2+的溶液。 002615.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，在所述步骤 （3）中，通过加热、超声、微波处理或加入蛋白酶抑制剂，优选通过加热将酶灭活。 002716.如段落15所述的方法，其中，所述加热在75-95、优选85的温度下进行。 002817.如段落15或16所述的方法，其中，所述加热进行10-30min、优选20min。 002918.如段落1-17中任一段所述的方法，其中，在所述步骤 （3）中，将所述离心得到的上清液置于喷射蒸煮器中，在100-180、优选130-160的温度下进行杀菌处理。 003019.如段落1-18中任一段所述的方法，其中，所述步骤 （3）中的喷雾干燥温度为进口温度150-200，出口温度50-100。 003120.如段落19所述的方法，其中，所述进口温度为170-190。 003221.如段落19或20所述的方法，其中，所述出口温度为70-90。 0033该方法所得大豆肽苦涩味低，大豆肽得率高，其中的游离氨基酸的含量以及分子量小于150Da或分子量大于2000Da的肽段含量均较低，分子量介于150Da和2000Da之间的肽段含量高。 具体实施方式0034本发明涉及一种通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的生产方法。 该方法所得的大豆肽苦涩味低，大豆肽得率高，其中的游离氨基酸的含量及分子量小于150Da或分子量大于2000Da的肽段含量均较低，分子量介于150Da和2000Da之间的肽段含量高。 0035本发明所述的方法包括如下步骤0036 （1）将大豆分离蛋白加水配制成4wt%-12wt%、优选6wt%-10wt%的大豆分离蛋白液，制备大豆分离蛋白液；0037 （2）向步骤 （1）中制备的大豆分离蛋白液中滴加酸性调节剂或碱性调节剂，调节pH至5.0-9. 0、优选7.0-8.0，调节温度至30-60、优选45-55，然后，加入作为内肽酶使用的碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解1-3h，再加入作为外肽酶使用的风味蛋白酶，酶解1-3h；0038 （3）酶解结束后，调节酶解液的pH至4.0-5.0，将酶灭活，1000g-5000g离心10-30min，取上清液，置于100-180、优选130-160的温度下杀菌处理30-120s、优选60-90s，之后喷雾干燥得到大豆肽。 0039本发明中的术语“碱性调节剂”是指能够在溶液中提供OH-的任意碱或其相应的碱性盐，例如NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液等。 0040本发明中的术语“酸性调节剂”是指能够在溶液中提供H+的任意无机酸、有机酸或它们相应的酸性盐，例如盐酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液、柠檬酸溶液、乙酸溶液以及与它们说明书104719611A54/8页6相对应的食品领域中常用的酸性盐等。 0041本发明中所提及的碱性蛋白酶是指在碱性pH环境下（如，pH7. 0、优选pH为7.08.0）作用于多肽链内部的肽键从而发挥内肽酶活性的一类蛋白酶，例如碱性丝氨酸蛋白酶、碱性天冬氨酸蛋白酶和碱性金属蛋白酶，优选Alkaline protease（丹尼斯克）、Alcalase2.4L FG（诺维信）。 0042本发明中所提及的中性蛋白酶是指在中性pH环境下（如，pH为6.07. 5、优选7.0）作用于多肽链内部的肽键从而发挥内肽酶活性的一类蛋白酶，包括霉菌中性蛋白酶和细菌中性蛋白酶，优选Alphalase（丹尼斯克）、Neutrase0.8L（诺维信）。 0043本发明中所提及的风味蛋白酶是指作用于多肽链氨基端或羧基端的肽键从而催化底物形成特定食品风味的一类复合蛋白酶，例如分离自果蔬中的风味蛋白酶、米曲霉发酵所得风味蛋白酶，优选Foodpro51FP（丹尼斯克）、Flavourzyme（诺维信）。 0044其中，所述步骤 （1）中的水为自来水、去离子水、双蒸水和/或超纯水等，优选去离子水。 0045所述步骤 （2）和步骤 （3）中的碱性调节剂优选为NaOH溶液，酸性调节剂优选为磷酸溶液或盐酸溶液。 0046所述步骤 （2）中的酶解在水浴锅、恒温箱、烘箱或恒温加热器等能够提供恒定温度（如30-60）的装置中进行。 所述步骤 （3）中的酶的灭活亦可在上述装置中进行。 0047在所述步骤 （2）中，可任选在加入碱性蛋白酶之前或之后，进一步向大豆分离蛋白液中加入含有Ca2+的溶液，从而稳定所使用的碱性蛋白酶。 0048所述步骤 （2）中碱性蛋白酶添加量为0.5wt%-5wt%、优选0.5wt%-2wt%；中性蛋白酶添加量为0.5wt%-5wt%、优选0.5wt%-2wt%；风味蛋白酶添加量为0.1wt%-3wt%、优选0.2wt%-1wt%；其中，所述碱性蛋白酶和所述中性蛋白酶的添加量可以相同或不同。 0049所述步骤 （3）中，通过加热、超声、微波处理或加入蛋白酶抑制剂等手段将酶灭活，优选通过加热将酶灭活。 0050所述步骤 （3）中，通过在75-95、优选85的温度下加热将酶灭活，优选所述加热进行10-30min、更优选20min。 0051所述步骤 （3）中，离心得到的上清液置于喷射蒸煮器中，在100-180、优选130-160的温度下进行杀菌处理。 0052所述步骤 （3）中喷雾干燥的温度为进口温度150-200、优选170-190，出口温度50-100、优选70-90。 0053实施例0054下面将通过实施例、比较例和效果实验例对本发明进行具体描述。 然而应当理解的是，本发明的保护范围并不限于这些实施例。 0055实施例10056将大豆分离蛋白加水配制成4wt%的大豆分离蛋白液，采用2mol/L的氢氧化钠或者2mol/L的磷酸溶液调节pH至7.0，调节温度至60，相对于大豆分离蛋白的干重而言，先加入2wt%的Alkaline protease（丹尼斯克）和0.5wt%的Alphalase（丹尼斯克，酶解1h，之后加入1wt%的Foodpro51FP（丹尼斯克），酶解1h。 酶解结束后，调节酶解液pH到4.5，75加热30min灭酶，1000g离心10min，取上清液，加入至喷射蒸煮器（ESCS-M103，上说明书104719611A65/8页7海晓乐东潮生物技术开发有限公司）内，并在130杀菌处理90s，之后喷雾干燥得到大豆肽产品。 其中，所述喷雾干燥设备控制进口温度为200、出口温度为100。 0057实施例20058将大豆分离蛋白加水配制成12wt%的大豆分离蛋白液，采用2mol/L的氢氧化钠或者2mol/L的盐酸溶液调节pH至5.0，调节温度至30，相对于大豆分离蛋白的干重而言，先加入5wt%的Alcalase2.4L FG（诺维信）和5wt%的Neutrase0.8L（诺维信），酶解3h，之后加入0.1wt%的Flavourzyme（诺维信），酶解3h。 酶解结束后，调节酶解液pH到4.0，85加热20min灭酶，3000g离心20min，取上清液，加入至喷射蒸煮器（ESCS-M103，上海晓乐东潮生物技术开发有限公司）内，并在100杀菌处理120s，之后喷雾干燥得到大豆肽产品。 其中，所述喷雾干燥设备控制进口温度为170、出口温度为70。 0059实施例30060将大豆分离蛋白加水配制成10wt%的大豆分离蛋白液，采用2mol/L的氢氧化钠或者2mol/L的盐酸溶液调节pH至9.0，调节温度至45，相对于大豆分离蛋白的干重而言，先加入0.5wt%的Alcalase2.4L FG（诺维信）和2wt%的Neutrase0.8L（诺维信），酶解2h，之后加入3wt%的Flavourzyme（诺维信），酶解2h。 酶解结束后，调节酶解液pH到5.0，95加热10min灭酶，5000g离心30min，取上清液，加入至喷射蒸煮器（ESCS-M103，上海晓乐东潮生物技术开发有限公司）内，并在180杀菌处理30s，之后喷雾干燥得到大豆肽产品。 其中，所述喷雾干燥设备控制进口温度为150、出口温度为50。 0061实施例40062将大豆分离蛋白加水配制成6wt%的大豆分离蛋白液，采用2mol/L的氢氧化钠或者2mol/L的磷酸溶液调节pH至8.0，调节温度至55，相对于大豆分离蛋白的干重而言，先加入1wt%的Alkaline protease（丹尼斯克）和1wt%的Alphalase（丹尼斯克），酶解3h，之后加入0.2wt%的Foodpro51FP（丹尼斯克），酶解1h。 酶解结束后，调节酶解液pH到4.5，85加热20min灭酶，3000g离心20min，取上清液，加入至喷射蒸煮器（ESCS-M103，上海晓乐东潮生物技术开发有限公司）内，并在160杀菌处理60s，之后喷雾干燥得到大豆肽产品。 其中，所述喷雾干燥设备控制进口温度为190、出口温度为90。 0063对比例10064将1wt%的Alkaline protease（丹尼斯克）、1wt%的Alphalase（丹尼斯克）与0.5wt%的Foodpro51FP（丹尼斯克）同时加入蛋白液中，酶解4h。 其他步骤与实施例4相同。 0065对比例20066将1wt%的Alkaline protease（丹尼斯克）、1wt%的Alphalase（丹尼斯克）加入蛋白液中，酶解4h，不添加风味蛋白酶。 其他步骤与实施例4相同。 0067对比例30068加入1wt%的Alkaline protease（丹尼斯克），酶解3h，之后加入0.5wt%的Foodpro51FP（丹尼斯克），酶解1h。 其他步骤与实施例4相同。 0069对比例40070酶解结束后，直接将酶解液3000g离心20min，取上清液。 其他步骤与实施例4相同。 说明书104719611A76/8页80071上述实施例与对比例中的大豆分离蛋白为市售的大豆分离蛋白产品（YP928Z，禹王集团）。 对于本领域技术人员来说可以理解的是，上述大豆分离蛋白还可以是根据本领域已知方法从豆粕中分离出的大豆分离蛋白。 0072上述实施例和对比例中所使用的喷雾干燥设备为江苏省范群干燥设备厂生产的LPG-5型离心喷雾干燥机。 另外，本发明所使用的喷雾干燥设备也可以为现有技术中的任何市售类型设备。 0073上述喷射蒸煮器可为本领域技术人员已知的具有类似功能的任何设备。 0074将实施例1-4和对比例1-4中制备的大豆肽样品进行如下评价。 0075（a）大豆肽得率及分子量分布0076大豆肽得率经灭酶和离心后所得上清液中蛋白质量与酶解前蛋白质量的比值。 蛋白质量均采用凯氏定氮法进行测定。 0077分子量分布采用高效凝胶过滤色谱法测定，即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm下检测。 对杆菌酶（1450Da）、抑肽酶(6511.44Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451Da）和细胞色素C（12355Da）五种标准物质分别进行分离测试，以各标准物质分子量的对数（lgMr）相对于保留时间（tR）通过线性回归得到分子质量校准曲线及其方程式，之后将供试品的色谱保留时间代入校准曲线中，计算得到供试品的相对分子量大小及分子量的分布范围。 0078实验仪器及参数0079高效液相色谱仪Agilent，1200；0080紫外分光光度计尤尼柯，WFZ UV-2100；0081色谱柱TSK-GEL G2000SW XL（7.8300mm）；柱温30；流速0.5mL/min；检测波长220nm；0082流动相及洗脱条件乙腈:水:三氟乙酸=10:90:0.1；使用乙腈:水:三氟乙酸=10:90:0.1进行30min的等度洗脱。 0083表1实施例和对比例所制备的大豆肽