植物的抗性(低温、高温)评价测定实验方法.doc

植物的抗性（低温、高温）评价测定实验方法（张平贤收集）实验一 植物体内游离脯氨酸含量的测定一、目的在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。三、材料、仪器及试剂1. 材料：植物叶片。2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。3 .试剂及配制：2.5酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6molL1磷酸中，搅拌加热（70）溶解，贮于4冰箱中,2-3日有效。3磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。10gml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100gml1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10gml-1脯氨酸标准液。100gml1脯氨酸母液:称10mg脯氨酸溶于少量的乙醇中，用蒸馏水定容至100ml冰醋酸；甲苯。四、实验步骤1、脯氨酸标准曲线的制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为012g的脯氨酸标准液。加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。试 剂管 号01234510gml-1脯氨酸标准液（ml）蒸馏水（ml）冰醋酸（ml）2.5酸性茚三酮（ml）02240.21.8240.41.6240.61.4240.81.2241.01.024每管脯氨酸含量（g）02468101.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。1.3标准曲线的绘制以15号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的测定2.1脯氨酸的提取称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。2.2测定吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸、2ml H2O、4ml 2.5酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。五、计算结果从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：X提取液总量（ml）脯氨酸含量（gg1Fw） 样品鲜重（g） 测定时提取液用量（ml）公式中：X 从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g）六、注意事项:1.配置的酸性茚三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配。2.测定样品若进行过渗透胁迫处理，结果会更显著。3.试剂添加次序不能出错。实验二 植物体内丙二醛含量的测定一、目的通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。二、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑2、4二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100300gg1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5nmol L1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片。2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3. 试剂：10三氯乙酸；0.6硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。四、实验步骤（1）提取采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，2002）。取叶片，洗净擦干后去中脉。称取0.5 g样品，加5%三氯乙酸2 mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml 三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000 rpm，离心10min。（2）显色取上清液2 mL，加0.6% TBA 2 mL，混合后在100水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在532 nm和600 nm处的吸光度值，MDA质量摩尔浓度(nmol/g)=( A532-A600)VZV1/(0.155WV2)式中：VZ: 反应液总量(4 mL)； V1: 提取液体积(10 mL)； V2: 测定用用提取液量(2 mL)； W: 取样叶鲜重(g)0.155:为MDA的消光系数（nmol/l）五、结果计算由于蔗糖-TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4103，MDA-TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4103和155103,532nm非特异性吸光值可以在600nm处的吸光值为代表。A450=(85.4103)C糖A532-A600=（155103）CMDA+(85.4103)C糖解，得C糖= A450/(85.4103)=11.71 A450 (mmol/L)CMDA=6.45(A532-A600)-0.56 A450(umol/L)式子中，A450在450nm波长下测得的吸光度值A532在532nm波长下测得的吸光度值A600在600nm波长下测得的吸光度值C糖、CMDA分别是反应混合溶液中可溶性糖、MDA的浓度实验三 SOD活力测定(NBT还原法)一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一） 仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（二）试剂（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液：A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4冰箱中保存备用。（2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4冰箱中保存可用12d。（3）7.5 104 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4冰箱中保存可用23d。（4）含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4冰箱中保存可用810d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L 核黄素溶液。（5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。三、实验步骤 1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：依次加入0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5ml，130mmol/L Met溶液0.3ml，750mol/L NBT溶液0.3ml，100mol/L EDTANa2液0.3ml，20mol/L 核黄素0.3ml，蒸馏水0.5ml。2支测定管加酶液0.1ml（2支对照管以缓冲液代替，加0.1ml），混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min，然后立即遮光，以遮光管为对照调零，于560nm下测定光密度。（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3.SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt)SOD比活力SOD总活性/蛋白质含量上式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示； SOD比活力：单位以酶单位mg蛋白表示Ack：照光对照管的吸光度 AE：样品管的吸光度V：样品液总体积（ml） Vt测定时样品用量（ml）W：样鲜重（g） 蛋白质含量单位为：mg蛋白g鲜重实验四 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。25分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.011.0mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。三、材料、试剂与器具1 试剂1.1染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85